用于定量檢測PEG和PEG修飾性蛋白的ELISA試劑盒

應用：此試劑盒僅用于科研，不可用于診斷和治療

背景：生物制劑PEG化后可通過減緩蛋白水解和從循環系統中清除的速率來延長半衰期。PEG化蛋白的藥效學可通過蛋白自身的特異性分析來進行評估，但這些方法需要消耗大量時間，且建立目標蛋白的ELISA昂貴。西寶生物供應PEG ELISA試劑盒，可以檢測PEG化蛋白的PEG段，因此可用于PEG化蛋白藥效學的評估。

產品介紹：

分析試劑盒是直接競爭ELISA。共價結合甲氧基-PEG的BSA（牛血清白蛋白）包被在96孔微孔板上。稀釋的樣品和包含PEG化蛋白的標準品（50ul）加到微孔板中，結合抗-PEG的辣根過氧化物酶（HRP 抗-PEG,50ul）加到微孔板中，微孔板在微孔板振蕩器上孵育1小時。沖洗微孔板，TMB，HRP底物（100ul）加入到孔中孵育20分鐘，會產生藍色。加入1N HCL（100ul）終止反應，顏色將由藍色變為黃色，檢測其在450nm處的吸光值。如果樣品中含PEG，它就會與包被在板上的PEG競爭結合HRP 抗-PEG，吸光度值會減小。

ELISA試劑盒中使用的抗體是小鼠單克隆抗體，對聚乙二醇主鏈具有專一性。研究表明此試劑盒可用于檢測包含1個或多個PEG鏈的蛋白和未結合的PEG。靈敏度會隨著PEG鏈的長度增加和PEG化的程度而增大，因此我們可以產生一個標準曲線。試劑盒提供標準品是帶20kDa mPEG鏈的BSA，用戶可以用標準品去確認試劑盒的性能。

試劑盒中包含內容：
PEG包被的96孔微孔板（12個可拆開的條，每條有8個孔），在-20℃下儲存
HRP抗-PEG復合物，20ul（1瓶），在-20℃下儲存
HRP PEG稀釋液，50ml
PEG-BSA標準品，20ul（1瓶），在-20℃下儲存
HRP PEG清洗緩沖液（20×）,50ml
TMB試劑，11ml
終止液，11ml

需要準備的耗材如下：
精確的移液器和槍頭
蒸餾水或去離子水
聚丙烯或玻璃管
混合儀
吸水紙或紙巾
微孔培養儀/混合器（混合速度～150轉/分鐘）
平板墊圈
450nm處光密度范圍在0-4的平板閱讀器
繪圖軟件

試劑盒標準液的制備

1. 標記8支聚丙烯管或玻璃管，濃度為1000,200,40,8,1.6,0.32,0.064和0ng/ml
2. 制備1000ng/ml的標準品，在PEG標準品標簽上進行描述
3. 加入200ul的稀釋液到管中，標記為200,40,8,1.6,0.32，0.064和0ng/ml
4. 吸取50ul的1000ng/ml PEG標準品到管子中，標記200ng/ml，并混合。此試劑盒提供200ng/ml PEG-BSA標準品。
5. 通過5倍連續稀釋制備40,8,1.6,0.32和0.064ng/ml的標準品

分析過程

1. 保護支持板上合適數量的包被孔
2. 吸取50ul標準品和樣品到孔中（建議標準品和樣品分別一式三份）
3. 加入50ul的HRP 抗-PEG復合物到孔中
4. 在150轉每分鐘的微孔板振蕩器上室溫（25℃）孵育1小時
5. 使用一個平板墊圈，清洗孔6次，每孔加入400ul的清洗液
6. 在吸水紙或紙巾上急劇地敲擊孔，去掉剩余的清洗液
7. 吸取100ul的TMB試劑到每個孔中
8. 在150轉/分鐘的微孔板振蕩器上輕輕地混合20分鐘
9. 加入100ul的終止液到每個孔中終止反應
10. 輕輕混合直到藍色變為黃色
11. 5分鐘內讀取450nm處的吸收值

結果計算

1. 讀取參考標準品和樣品在450nm處的平均吸光值
2. 用平均吸光值和濃度的lg值做標準曲線，Y軸是吸光值，X軸是濃度
3. 將數據建立S形曲線模型。曲線的上線是濃度為0ng/ml處的吸光值，曲線的下線是濃度為1000ng/ml處的吸光值
4. 使用每個樣品的平均吸光值來確定PEG化蛋白的Log10濃度值，然后計算出濃度值
5. 建議落在標準曲線內50%區域的吸光值來確定PEG的濃度。比如，吸光度值范圍在0.1和1.6.那么樣品的吸光度值應該在1.225和0.475的范圍
6. 計算出濃度，然后乘以稀釋因子來計算出血清或血漿樣品中PEG化蛋白的實際濃度
7. 如果樣品的吸光度值不在標準曲線范圍內，樣品需要重新稀釋和檢測

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