用于定量檢測PEG和PEG修飾性蛋白的ELISA試劑盒

應(yīng)用：此試劑盒僅用于科研，不可用于診斷和治療

背景：生物制劑PEG化后可通過減緩蛋白水解和從循環(huán)系統(tǒng)中清除的速率來延長半衰期。PEG化蛋白的藥效學(xué)可通過蛋白自身的特異性分析來進(jìn)行評估，但這些方法需要消耗大量時(shí)間，且建立目標(biāo)蛋白的ELISA昂貴。西寶生物供應(yīng)PEG ELISA試劑盒，可以檢測PEG化蛋白的PEG段，因此可用于PEG化蛋白藥效學(xué)的評估。

產(chǎn)品介紹：

分析試劑盒是直接競爭ELISA。共價(jià)結(jié)合甲氧基-PEG的BSA（牛血清白蛋白）包被在96孔微孔板上。稀釋的樣品和包含PEG化蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品（50ul）加到微孔板中，結(jié)合抗-PEG的辣根過氧化物酶（HRP 抗-PEG,50ul）加到微孔板中，微孔板在微孔板振蕩器上孵育1小時(shí)。沖洗微孔板，TMB，HRP底物（100ul）加入到孔中孵育20分鐘，會產(chǎn)生藍(lán)色。加入1N HCL（100ul）終止反應(yīng)，顏色將由藍(lán)色變?yōu)辄S色，檢測其在450nm處的吸光值。如果樣品中含PEG，它就會與包被在板上的PEG競爭結(jié)合HRP 抗-PEG，吸光度值會減小。

ELISA試劑盒中使用的抗體是小鼠單克隆抗體，對聚乙二醇主鏈具有專一性。研究表明此試劑盒可用于檢測包含1個(gè)或多個(gè)PEG鏈的蛋白和未結(jié)合的PEG。靈敏度會隨著PEG鏈的長度增加和PEG化的程度而增大，因此我們可以產(chǎn)生一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。試劑盒提供標(biāo)準(zhǔn)品是帶20kDa mPEG鏈的BSA，用戶可以用標(biāo)準(zhǔn)品去確認(rèn)試劑盒的性能。

試劑盒中包含內(nèi)容：
PEG包被的96孔微孔板（12個(gè)可拆開的條，每條有8個(gè)孔），在-20℃下儲存
HRP抗-PEG復(fù)合物，20ul（1瓶），在-20℃下儲存
HRP PEG稀釋液，50ml
PEG-BSA標(biāo)準(zhǔn)品，20ul（1瓶），在-20℃下儲存
HRP PEG清洗緩沖液（20×）,50ml
TMB試劑，11ml
終止液，11ml

需要準(zhǔn)備的耗材如下：
精確的移液器和槍頭
蒸餾水或去離子水
聚丙烯或玻璃管
混合儀
吸水紙或紙巾
微孔培養(yǎng)儀/混合器（混合速度～150轉(zhuǎn)/分鐘）
平板墊圈
450nm處光密度范圍在0-4的平板閱讀器
繪圖軟件

試劑盒標(biāo)準(zhǔn)液的制備

1. 標(biāo)記8支聚丙烯管或玻璃管，濃度為1000,200,40,8,1.6,0.32,0.064和0ng/ml
2. 制備1000ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，在PEG標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上進(jìn)行描述
3. 加入200ul的稀釋液到管中，標(biāo)記為200,40,8,1.6,0.32，0.064和0ng/ml
4. 吸取50ul的1000ng/ml PEG標(biāo)準(zhǔn)品到管子中，標(biāo)記200ng/ml，并混合。此試劑盒提供200ng/ml PEG-BSA標(biāo)準(zhǔn)品。
5. 通過5倍連續(xù)稀釋制備40,8,1.6,0.32和0.064ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品

分析過程

1. 保護(hù)支持板上合適數(shù)量的包被孔
2. 吸取50ul標(biāo)準(zhǔn)品和樣品到孔中（建議標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別一式三份）
3. 加入50ul的HRP 抗-PEG復(fù)合物到孔中
4. 在150轉(zhuǎn)每分鐘的微孔板振蕩器上室溫（25℃）孵育1小時(shí)
5. 使用一個(gè)平板墊圈，清洗孔6次，每孔加入400ul的清洗液
6. 在吸水紙或紙巾上急劇地敲擊孔，去掉剩余的清洗液
7. 吸取100ul的TMB試劑到每個(gè)孔中
8. 在150轉(zhuǎn)/分鐘的微孔板振蕩器上輕輕地混合20分鐘
9. 加入100ul的終止液到每個(gè)孔中終止反應(yīng)
10. 輕輕混合直到藍(lán)色變?yōu)辄S色
11. 5分鐘內(nèi)讀取450nm處的吸收值

結(jié)果計(jì)算

1. 讀取參考標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在450nm處的平均吸光值
2. 用平均吸光值和濃度的lg值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y軸是吸光值，X軸是濃度
3. 將數(shù)據(jù)建立S形曲線模型。曲線的上線是濃度為0ng/ml處的吸光值，曲線的下線是濃度為1000ng/ml處的吸光值
4. 使用每個(gè)樣品的平均吸光值來確定PEG化蛋白的Log10濃度值，然后計(jì)算出濃度值
5. 建議落在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)50%區(qū)域的吸光值來確定PEG的濃度。比如，吸光度值范圍在0.1和1.6.那么樣品的吸光度值應(yīng)該在1.225和0.475的范圍
6. 計(jì)算出濃度，然后乘以稀釋因子來計(jì)算出血清或血漿樣品中PEG化蛋白的實(shí)際濃度
7. 如果樣品的吸光度值不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，樣品需要重新稀釋和檢測

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