檢測PI 3-激酶活性的試劑盒

僅用于體外實驗，質量保證12個月。在-20℃下儲存，避免反復冷凍/復溶 

試劑盒組成

2×反應緩沖液（2×1.5ml）
1mM ATP（400ul）
脂類底物（8管）                                                        
對照PI 3-激酶（5ug）

您需要提供以下試劑和耗材

(γ³²P)-ATP
1M HCL
三氯甲烷/甲醇 1:1
2M乙酸/異丙醇 1:2
硅膠TLC平板
閃爍計數器

描述
PI 3-激酶分析試劑盒為高靈敏和定量檢測PI 3-激酶活性或篩選PI 3-激酶抑制劑提供了高效且操作簡單的工具。

PI3-激酶活性由放射性標記(γ³²P)-ATP的量來進行評估；底物隨后使用薄層色譜分離出來，且它的放射性在閃爍計數器中進行檢測

背景

磷脂酰肌醇三激酶（PI3Ks）是一家族的酶，在細胞調節機制中發揮著關鍵作用。PI3Ks可以磷酸化磷酸肌醇(PIs)的3’-OH位置產生油脂二級信號。此功能可與許多生化反應聯系，比如細胞生長，細胞分離，細胞生存，細胞增殖和遷移。基于結構相似性和底物專一性，PI3K家族可以分為I,II和III三個級別。

所有的人Class I由催化亞族（分子量大約：110kDa）和非催化亞族（分子量50,55,85,87或101KDa）組成。他們是磷酸肌醇（PI），磷酯酰肌醇-4-單-磷酸(PIP)和磷脂酰肌醇-4，5-雙磷酸（PIP2)。

制備(γ³²P)-ATP混合液

制備ATP和(γ³²P)-ATP混合液，濃度為240uM.每次分析需要10ul的(γ³²P)-ATP混合液

制備脂質底物

每一脂質底物瓶中包含一定量的PI，可以分析12次，在瓶中裝滿脂質底物和125ul的水，充分搖勻。
在超聲水浴鍋中超聲1h

激酶分析

按照下面的配方制備激酶分析混合液
反應緩沖液：25ul
脂質底物：10ul
酌情稀釋的PI 3激酶樣品：5ul
室溫下孵育5分鐘
加入10ul的(γ³²P)-ATP混合液啟動反應
37℃環境下培養15分鐘
加入100ul HCL（1M）終止反應并搖勻

萃取油脂

加入三氯甲烷/甲醇1:1 300ul
漩渦混合混合液，離心1分鐘，分離兩相
去除上層水相
用400ul HCL（1M）清洗有機相，去除水相

定量

將100ul的有機相轉移到硅膠TLC平板中，在2M的乙酸/異丙醇（1:2）中運行
暴露平板，進行觀察；PI 3-激酶放在閃爍計數器中進行定量
100ul的清洗過的三氯甲烷相可以通過液體閃爍器進行計數

官網：www.baichuan365.com	微信服務號：iseebio	微博：seebiobiotech

商城：mall.seebio.cn	微信訂閱號：seebiotech	泉養堂：www.canmedo.com