日本香川大學(xué)醫(yī)學(xué)部 藥物生物體情報(bào)學(xué)講座 塚本郁子

血管新生及舊血管里極造新血管的過程，在胎兒生長(zhǎng)、創(chuàng)傷診治、腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移等過程中起重要作用。尤其是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的必經(jīng)階段，一直以來很多人把血管新生的抑制劑作為抗腫瘤劑研究1，2)。而相對(duì)應(yīng)的血管新生促進(jìn)劑同樣是治療血流灌注不足等諸多癥狀的必需品，但它的實(shí)際應(yīng)用并不多。主要是因?yàn)槌藦纳矬w提供的增殖因子外，有此作用的其他物質(zhì)人們幾乎都不了解。血流灌注不足是由于糖尿病患者慢性閉塞性動(dòng)脈硬化、脈管炎及其他動(dòng)脈硬化等各種血管閉塞等引起的。故創(chuàng)傷診治、血管新生治療被寄予厚望。但目前的血管新生治療只限于向增殖因子患部注射進(jìn)行基因治療等方法3-5），人們期待能研發(fā)出穩(wěn)定、新型的低分子。本文中作者及團(tuán)隊(duì)將闡述新型低分子化合物2-Cl-C.OXT-A 在血管新生方面的作用。2-Cl-C.OXT-A的活性表達(dá)過程

前期作者以稀少糖6）為中心進(jìn)行單糖的生理活性研究。在各種生理活性的報(bào)告中，主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞在管腔形成的影響。通過血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔，是生物體血管新生的模型。該實(shí)驗(yàn)篩選了超過40 種單糖的效果，并確定一部分的稀少糖、核糖、2-脫氧核糖里有管腔形成抑制作用7）。核糖、2-脫氧核糖是眾所周知的生物體內(nèi)核酸組成成分。為此把研究對(duì)象擴(kuò)大到單糖衍生體的核酸，一同篩選生物體來源的核苷、核苷酸、核酸醫(yī)藥品、合成核酸和其衍生體等活性。研究的核酸達(dá)30多種。意料之中，多數(shù)核酸會(huì)抑制管腔形成，其中只有一種物質(zhì)顯示了強(qiáng)大的促進(jìn)作用。此物質(zhì)就是本文要介紹的2-Cl-C.OXT-A 8）。

圖1 結(jié)構(gòu)式是日本德島文理大學(xué)香川藥學(xué)部的丸山德見教授按照Basacchi 及其團(tuán)隊(duì)的方法9）合成出來的。2-Cl-C.OXT-A 的2 位被氯化的腺嘌呤上，沒有與核糖、2-脫氧核糖結(jié)合，反而是結(jié)合了有兩個(gè)羥甲基的丁烷環(huán)的結(jié)極。同樣的丁烷環(huán)里結(jié)合了核酸堿基鳥嘌呤的C.OXT-G 被開發(fā)成叫做Lobucavir 的抗病毒藥，與現(xiàn)在經(jīng)常使用的抗病毒藥Ganciclovir 有相似的結(jié)極10）。為了認(rèn)論2-Cl-C.OXT-A 相關(guān)活性結(jié)極，我們對(duì)圖1 里化合物的活性進(jìn)行了比較。

將人類臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和人類成纖維細(xì)胞一同培養(yǎng)，HUVEC 會(huì)形成管腔。在此基礎(chǔ)上我們研究了一系列添加劑的效果。在培養(yǎng)基里添加1μM、10μM、100μM 等不同濃度的2-Cl-C.OXT-A，各濃度下形成的管腔如圖2 所示。不但陽性對(duì)照的VEGF（Vascular Endothelial Growth Factor A）、2-Cl-C.OXT-A 的促管腔形成作用很明顯，甚至比VEGF更強(qiáng)，并丏這種作用與濃度緊密相關(guān)。無添加對(duì)照形成的管腔面積為1 時(shí)，2-Cl-C.OXT-A 相對(duì)值為1μM 為1.36±0.40、10μM 為2.44±0.89、100μM 為3.78±1.09。VEGF 值為1.84±0.48（各n=9、mean±SD），說明10μM 的2-Cl-C.OXT-A比VEGF 有相當(dāng)甚至更好的作用，而100μM 的2-Cl-C.OXT-A 的作用是VEGF 的2 倍。這種促進(jìn)作用在去除了2-Cl-C.OXT-A 腺嘌呤部分的堿基，（圖1 的C.OXT-A），腺嘌呤發(fā)成鳥嘌呤（圖1 的C.OXT-G）后消失。2-Cl-腺嘌呤的結(jié)極是這個(gè)生理活性所必須的。但是，只有2-Cl-腺嘌呤結(jié)極是與夠的。圖1 所示的2-Cl-腺苷、2-Cl-2’-脫氧腺苷雖然有2-Cl-腺嘌呤結(jié)極，卻沒有管腔形成促進(jìn)活性。說明活性表達(dá)需要含有鹵化的腺嘌呤和有兩個(gè)羥甲基的丁烷環(huán)兩個(gè)條件。2-Cl-C.OXT-A 的管腔形成促進(jìn)作用的峰值在100
μM，超過了這個(gè)濃度其作用就會(huì)減弱，超過1000μM 后會(huì)轉(zhuǎn)為抑制作用。

生物體里血管新生時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔前后，會(huì)發(fā)生血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。例如腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌血管新生誘發(fā)因子VEGF，再以此向附近的血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)血管新生的指令。接叐了指令，血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)發(fā)出遷移，并極建新的血管的信號(hào)。利用HUVEC 的增殖和遷移研究2-Cl-C.OXT-A 的效果時(shí)，發(fā)現(xiàn)2-Cl-C.OXT-A 在會(huì)促進(jìn)管腔形成的濃度（10-100μM）下，會(huì)促進(jìn)HUVEC 的增殖和遷移。 

圖1、2-Cl-C.OXT-A 及其類似化合物的結(jié)極式
圖2、2-Cl-C.OXT-A 促進(jìn)HUVEC 的管腔形成

生物體內(nèi)血管新生的啟勱子（Promoter）已知有好幾種，其中有名的是VEGF。在血管存在的位置就會(huì)分泌VEGF，并與附近的血管內(nèi)皮細(xì)胞里存在的叐體結(jié)合從而誘導(dǎo)血管新生11）。關(guān)于此過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究很多，但依然有許多與明點(diǎn)。作者使用經(jīng)典的通路MAP kinase cascade 相關(guān)的磷酸化抗體來研究2-Cl-C.OXT-A 的作用。圖3 所示，添加了2-Cl-C.OXT-A 10-15 分鐘后，促進(jìn)HUVEC 的MAP kinaseERK1/2 的磷酸化，同時(shí)下游的MAP kinase MEK 的磷酸化也改發(fā)。MEK inhibitor PD98059 不但會(huì)被2-Cl-C.OXT-A 抑制ERK1/2 的磷酸化，還會(huì)抑制HUVEC 的管腔形成。最后，由于2-Cl-C.OXT-A 的促進(jìn)管腔形成作用，它激活了MEK 相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。另外，在上游里添加VEGF 叐體的抑制劑SU5416 ， 對(duì)2-Cl-C.OXT-A 活性化ERK1/2 沒有影響，2-Cl-C.OXT-A 的作用點(diǎn)在其下游和MEK 的上游之間。

用In vivo檢驗(yàn)2-Cl-C.OXT-A 的血管新生作用，在In vivo作用下用雞胚尿囊絨膜和兔角膜研究。圖4 是雞胚尿囊絨膜的實(shí)驗(yàn)（CAM assay）結(jié)果。在孵化第11 日的胚絨尿膜里添加添加劑，放置于20μl 的Matrigel 里，培養(yǎng)42-48 小時(shí)后的胚絨尿膜形態(tài)。陰性對(duì)照沒有觀察到新生血管，添加了VEGF、2-Cl-C.OXT-A 的凝膠上觀察到新生血管，同時(shí)使附件的血管更靠近。兔角膜的使用方法（corneal micropocket assay）是在一邊眼角膜里制作的口袋，埋入含有添加劑的Φ3mm X 厚度0.5mm 的EVA（Ethylene vinyl acetate copolymer）薄膜，7 天后觀察。并在對(duì)眼里埋入無添加的薄膜作對(duì)照。陽性對(duì)照使用bFGF（basic fibroblast growth factor）。結(jié)果按照向薄膜延伸的新生血管的總長(zhǎng)度來評(píng)價(jià)，無添加對(duì)照長(zhǎng)度為1.62±0.85mm、bFGF 為6.96±1.18mm，然后2-Cl-C.OXT-A為5.72±0.46mm（各自n=5、mean±SE），2-Cl-C.OXT-A 與bFGF 陽性對(duì)照結(jié)論相同，證明2-Cl-C.OXT-A能有意增加血管新生。

從以上研究可看出2-Cl-C.OXT-A 在In vitro 里能促進(jìn)HUVEC 的管腔形成、增殖、遷移。這個(gè)作用里似乎與MAP kinasecascade 的MEK 磷酸化（活性化）相關(guān)。使用雞胚尿囊絨膜、兔角膜的In vivo 實(shí)驗(yàn)也確認(rèn)有血管新生的作用。

2-Cl-C.OXT-A是分子量284 的合成低分子化合物。化學(xué)性非常穩(wěn)定，2-Cl-C.OXT-A 粉末在常溫下也可保存。作者制作2mM 的生理鹽水溶液，保存在冰箱里，使用數(shù)月也沒有變質(zhì)。284 的分子量在藥劑學(xué)上是可經(jīng)皮膚、粘膜吸收的分子大小。如今為治療疾病，有人采用注射、基因?qū)牖瘜W(xué)性、生物學(xué)性都與穩(wěn)定的VEGF、FGF（Fibroblast growth factor）等的血管新生促進(jìn)物質(zhì)的方法。比起這些物質(zhì)，2-Cl-C.OXT-A 可做成藥膏、藥貼、涂劑等，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。另外，在HUVEC 里確認(rèn)了活性化的MAP kinase cascade 是在眾多細(xì)胞里存在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。不僅只有血管內(nèi)皮細(xì)胞里血管新生，也有可能對(duì)其他細(xì)胞其他功能產(chǎn)生影響。因此和光純藥推出2-Cl-C.OXT-A 研究用試劑，將對(duì)今后2-Cl-C.OXT-A 的相關(guān)研究十分有幫助。

【相關(guān)產(chǎn)品】

產(chǎn)品編號(hào)	品名	規(guī)格	包裝
032-21541	2-Cl-C.OXT-A	細(xì)胞生物學(xué)	1mg
038-21543	2-Cl-C.OXT-A	細(xì)胞生物學(xué)	5mg

Tsukamoto, I. et al .: “A novel nucleic acid analogue shows b angiogenic activity. ”, Biochem Biophys Res Commun., 399(4), 699-704(2010).