人二倍體細胞株來源于正常人胎兒組織，主要用于培養病毒制備疫苗等。

A細胞株的要求

　　用于疫苗生產的人二倍體細胞株（以下簡稱細胞株）須按下列規定進行全面檢定。新建立細胞株，應按《新生物制品審批辦法》進行審批。

　　1　建立細胞株必須具備下列資料

　　1.1　建立細胞株所用的胎兒的胎齡和性別，中止妊娠原因。

　　1.2　建立細胞株所用胎兒的父、母年齡、職業及健康狀況，胎兒父、母系三代應無明顯遺傳缺陷和腫瘤疾病歷史。在取胎兒組織時，應作出詳細調查，報衛生部審批前，應進行一次重復調查。

　　1.3　原始組織種類，原代培養的數量與生長狀況。

　　1.4　細胞培養史和生長特征，細胞壽命、世代數。

　　1.5　細胞生長液的成分。

　　2　細胞株的檢定

　　2.1　染色體的鑒定和制片

　　細胞原系建株過程，每8～12世代*應作一次染色體檢查，一株細胞整個生命期內連續培養過程中，至少應有4～5次染色體檢查結果。

　　每次染色體檢查，應從同一世代不同細胞培養瓶中取細胞混合再培養，制備染色體標本片。染色體標本應長期保存（直至褪色不能用為止），以備復查。

　　每次染色體檢查，至少應隨機取1000個分裂中期細胞，進行染色體數目、形態和結構檢查，并作出有助于復查的記錄，其中至少選擇50個分裂中期細胞進行顯微照相，作出核型分析。并應粗數500個分裂中期細胞，檢查多倍體的發生率。

　　可以G分帶或Q分帶技術檢查50個中期細胞染色體帶型，應用照相圖片作出帶型分析。以顯帶技術檢出的核型異常（假二倍體、倒位、易位等）發生率應用比現用上限更寬的基本數據進行評價，合格上限尚未定出。

　　2.1.1　合格要求

　　1000個和500個中醫細胞標本中，檢查異常率、合格的上限（可信限95%，Poison法）如表1。

表1

　　*亞二倍性超過上限時，可選用批標本片重數

　　**+一個中期細胞內超過53條染色體即為一個多倍體

　　2.1.2　染色體制片要求

　　應及時進行制片質量檢查，如發現細胞堆積，染色體分散不好等，由于技術原因不適于讀片時，可以及時重新制片。但已經讀片后，不斷因某項超過標準（亞二位性除外）而廢棄不算。如考慮到制片技術與質量問題，可重試兩次，當有一次結果與原結果相近時，又無可知原因，應以原結果為準。

　　2.2　外源因子檢查

　　細胞株不應有細菌、霉菌、支原體和病毒等污染。每8～12世代細胞培養物，應進行下列檢查。

　　2.2.1　細菌、霉菌、支原體檢查

　　按《生物制品無菌試驗規程》進行。

　　2.2.2　病毒檢查

　　2.2.2.1　細胞直接觀察及紅細胞吸附試驗

　　取混合瓶細胞樣品，接種小瓶或小管，長成單層后更換維持液，觀察2周，鏡檢細胞，應保持正常形態特征。培養7天，用0.2%～0.5%雞和豚鼠混合紅細胞懸液進行紅細胞吸附試驗，先置于4～8℃，后置于20～25℃，各30分鐘，兩次觀察結果均應為陰性。

　　2.2.2.2　細胞培養檢查

　　細胞培養的上清液混合樣品，至少接種4種細胞（原代人腎或猴腎細胞、原代兔腎細胞、人源傳代細胞和另一批人二倍體細胞）。接種的樣品量應占維持液的20%以上，于培養5～7天和14天時，進行紅細胞吸附試驗（見2.2.2.1項）。培養7天的上清液在同種細胞培養上盲傳一代，觀察14天，應無細胞病變，紅細胞吸附試驗應為陰性（在該試驗的細胞維持液中，允許加入少量該細胞培養用的牛血清，以利細胞維持和觀察）。

　　2.2.2.3　動物試驗檢查

　　用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和雞胚各一組。每組動物或雞胚接種受檢細胞不應少于10⁷。按表2所列要求進行試驗和觀察。如80%以上動物和雞胚健存，此試驗為通過。

　　2.2.2.4　其他檢查

　　細胞株傳代過程中，至少于2個不同世代水平進行包涵體、乙型肝炎表面抗原及電鏡檢查，結果均應為陰性。

　　2.3　腫瘤原體檢查

　　每8～12世代做一次細胞株的異種移植試驗，觀察細胞株有無致腫瘤性質，每次實驗使用6只乳鼠（3～5日齡）或體重8～10g小白鼠，經抗胸腺血清（ATS）處理，皮下接種活二倍體細胞（最適傳代的細胞），觀察14天，檢查有無結節形成。有結節或可疑病灶時，做病理切片檢查。試驗同時，用HeLa或其他人源傳代細胞系做陽性對照試驗，用動物數與處理方法同試驗組，接種被檢二倍體細胞數應為對照腫瘤細胞數的5倍以上。結果二倍體細胞株不應有移植瘤形成，而對照組細胞則應有80%或更多的動物有典型移植瘤出現（腫瘤結節需經病理組織學診斷）。

表2

　　*豚鼠于注射前及觀察4周作舊結核菌素試驗，應為陰性
**每只于背部皮內注射10處，每處0.1ml
***應用豚鼠和雞混合紅細胞作直接血凝試驗
可以用任何以免疫抑制劑處理，并對腫瘤細胞有同樣敏感性的其他動物試驗，如無胸腺小白鼠（nude nu/nu基因型等）。

　　3　細胞種子

　　細胞株傳代過程的早期，應選定適應世代數培養出大量細胞，制成懸液，分裝安瓿作為細胞種子。置液氮中凍存，以備細胞株建成后，大量供應細胞。

　　凍存的種子細胞活存率應在60%以上。凍存后一定時間，應至少復蘇培養一系至衰老期，并在不同傳代水平，檢查細胞株的生長、胞核學特征、異種移植等，證明細胞經凍存后的生物學性質無明顯改變。

B二倍體細胞用于疫苗生產的要求

　　1　細胞

　　1.1　細胞株

　　用于疫苗生產的細胞株，必須符合本規程要求。不含外源因子、核型正常、對病毒敏感和具有足夠多的細胞種子。可用KMB-17、2BS等細胞株。所用細胞株均須經衛生部批準。

　　1.2　細胞種子批

　　一個細胞種子批應有足夠量早世代細胞，分裝安瓿保存于液氮中，作為細胞種子。

　　2　生產用細胞種子批

　　用一個或數個細胞種子安瓿傳代增殖到適宜世代，具有一定量的均一細胞懸液，分裝安瓿，標明世代、安瓿號和凍存的日期，保存于液氮中，作為生產用細胞種子。

　　2.1　生產用細胞種子批檢定

　　2.1.1　細菌、霉菌、支原體檢查

　　按《生物制品無菌試驗規程》進行。

　　2.1.2　動物和雞胚檢查外源因子

　　用生產用細胞種子世代水平或至2/3世代壽命水平的細胞作檢定樣品。用下列動物和雞胚檢查：

　　各種動物和雞胚的接種法、觀察期，按照A2.2.2.3條進行。

　　2.1.3　腫瘤原性檢查

　　按A2.3項執行。

　　2.1.4　染色體的監測

　　檢查用于生產的最后一個世代或其后任一世代，至少檢查500個中期細胞的多倍性、染色體精確計數、斷裂率、結構異常及其他異常發生率，例如螺旋消失或初級次縊痕或次級次縊痕的明顯減弱等。按A2.1.1項進行評價。

　　生產用細胞庫細胞染色體監測用的染色體標本片和照片，應作為該細胞批監測此細胞生產疫苗批的記錄，永久保存。

　　3　生產用細胞的培養

　　3.1　從生產用細胞種子開始傳代培養，以適宜分種率連續傳代，直至增殖足夠量的細胞培養物用于生產。用于生產的細胞世代，應在細胞整個壽命期的前2/3世代內。

　　3.2　細胞外源因子檢查

　　于種毒當天，或在連續傳代種毒，于最后一次細胞種毒當天，此批細胞留取2%～5%不種毒，換維持液作為正常細胞對照，以檢查外源因子。從換液之日起觀察2周，細胞應無異常變化。

　　用換維持液0～2天的對照細胞上清液，接種原代兔腎、非人靈長類傳代細胞及另一批人二倍體細胞，接種樣品量應占維持液的20%。觀察14天，換液后5～8天用上清液，在相應細胞盲代一代，觀察14天，做血吸附試驗。

　　在收毒時，用0.2%～0.5%雞和豚鼠紅細胞，在2～8℃和20～25℃做血吸附試驗，應為陰性。

　　3.3　細胞鑒別試驗

　　在生產用細胞世代水平或其后數代，檢查300個中期細胞，計數多倍體，作100個中期細胞染色體檢查，應核型正常，鑒別確為本細胞無誤。

　　除染色體監測外，還可用HLA表面抗原鑒定試驗。

　　*細胞“世代”的說明：英文是“Population doubling”，簡寫“PD”，譯成“群體培增”，為通俗和習慣以名詞“世代”來表示。PD可按實際計數，增加一倍，或按細胞培養面積，增加一倍，為一個PD，即一個世代。也就是細胞以1:2分種率傳代則為一個世紀，以1:4分種率傳代則為2個世代，1:8分種率傳代則為3個世代。

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