血液中游離DNA萃取用試劑的開發

來源：Seebio.cn作者：西寶生物人氣：-發表時間：2012-01-12 14:59:00【大中小】

血液中游離DNA萃取劑的開發

DNA萃取劑法
1991年筆者們開發了作為當時DNA萃取試劑主流的、不使用苯酚或者氯仿等劇毒物質、而是在一根微型離心管中，進行連續操作的DNA萃取法“DNA萃取劑法”。DNA萃取劑是作為強蛋白質溶化劑而為大家所熟知的方法，我們利用該性質完成了簡便且具有高回收率的DNA萃取法。該方法是一種使用DNA萃取劑與蛋白質分解酶或者界面活性劑等物質，將蛋白質可溶化后，通過單純地添加醇類，優先沉淀/濃縮DNA的簡便方法。
在利用DNA萃取劑制造的試劑中，有適用于生物制劑（DNA Extractor Kit：編號No. 295-50201）、全血液、組織（DNA Extractor WB Kit：編號No. 291-50502）、毛發、指甲（DNA Extractor FM Kit：編號No.295-58501）、全血液、組織中的線粒體DNA（mtDNA Extractor WB Kit：編號No. 293-54401、mtDNA Extractor CT Kit：編號No. 291-55301）等各種對象的產品，其高回收率在作為從微小的試劑中萃取極微量的DNA的試劑方面受到了好評。而且，由于DNA萃取劑是一種很難向DNA中添加人為的氧化物的萃取方法，所以也作為檢測作為DNA損傷標記8-hydroxy-2’-deoxyguanosine（8-OH-dG）時的前處理試劑一直被廣泛地應用。
此次，筆者們發現，DNA萃取劑法具有可以高收率地萃取微量的DNA的優秀特性，把它開拓為新的DNA萃取劑具有極大的可能性。

血液中游離DNA
我們已經廣泛地得知腸癌中多階段遺傳因子變異為代表的癌抑制遺傳因子的惰性化及癌遺傳因子活性化等多種變異會誘發癌變。對于以ras、p53或者BRCA-1為代表的稱為癌相關遺傳因子的遺傳因子群，不只是研究其與誘發癌癥相關的活動與結構，還成為了開發利用這些的癌癥診斷方法的研究對象。遺傳因子診斷法具有潛在的力量，近年來在癌癥的早期診斷方法的開發方面發揮著中心作用。期待著其他與以前的腫瘤標記相同的使用血液的簡便且非侵襲的診斷方法。
從十九世紀七十年代初開始，不只是癌癥患者，在全身性紅斑狼瘡（SLE）等各種患者中，也出現了通過細胞的死亡與組織的傷害產生的游離DNA被血清（血漿）輸送出來的報告。其中，多數的報告為檢查出癌的相關遺傳因子，所以期待著把這種血液中游離DNA（plasma DNA）特別應用于癌的遺傳因子的診斷法中。
例如：有報告說明，血液中游離DNA的濃度與癌的發展與大小相關，在檢查出有p53與K-ras遺傳因子變異的患者中，經過腫瘤摘除手術后，如果在血液中游離DNA中繼續檢查出變異遺傳因子，那么再發與轉移的可確定率將很高，利用CEA等以前的標記也可以高概率地檢測出這些情況。
而且，使用血液中游離DNA的特定的微型衛星解析不只用于早期診斷，在對極可能患癌的高風險患者的診斷方面也表現出可以期待的可能性。而且，正在考慮對以非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer）為代表的肺癌等癌癥使用血液中游離DNA檢測p16癌抑制遺傳因子的高甲基化作用將成為診斷癌癥再發的強有力手段。
在血液中游離的DNA的檢測/解析中，隱藏著這種可能性，今后也將成為受人矚目的研究材料。所以，筆者們把利用“DNA萃取劑”的DNA萃取法作為血液中游離DNA分析的前處理試劑進行了適當的新萃取試劑的開發。
為了萃取人的血清（血漿）中浮游的DNA，此次開發的試劑調整了反應條件與試劑的組成，而且把調整后使其可以適應去除血液中含有的多種脂肪成分的乙醇液體配套化（商品名DNA Extractor SP Kit：編號No. 296-60501）。在這里，在介紹本新產品的內容的同時，介紹使用該試劑萃取血液中游離的DNA，進行放大檢測的實施實例。

DNA Extractor SP Kit：構成試劑
（使用100μl的試劑，分50次處理）
（1）酶反應液 10ml×1支
（2）蛋白質分解酶液體 250μl×1支
（3）DNA萃取劑溶液 15ml×1支
（4）乙醇液體 30ml×1支
（5）洗滌液（A） 50ml×1支
（6）洗滌液（B） 50ml×1支

DNA Extractor SP Kit：原醇
（1）把血清（血漿）添加至100μl、1.5ml微型離心管中。
（2）添加200μl的酶反應液體。
（3）添加5μl的蛋白質分解酶液體，用渦流攪拌器混合。
（4）在56℃的條件下保溫10分鐘。
（5）添加300μl的DNA萃取劑溶液，輕輕地混合。
（6）添加600μl的乙醇溶液，用渦流攪拌器混合。
（7）在室溫下放置10分鐘。
（8）使用12,000～20,000×g，在室溫下離心分離10分鐘。
（9）棄掉上清液，在紙巾上盡量去除上清殘液。
（10）在沉淀中添加1ml的洗滌液（A），用渦流攪拌器混合。
（11）使用12,000～20,000×g，在室溫下離心分離5分鐘。
（12）進行與步驟9同樣的操作，盡量去除上清殘液。
（13）在沉淀中添加1ml的洗滌液（B），用渦流攪拌器混合。
（14）使用12,000～20,000×g，在室溫下離心分離5分鐘。
（15）進行與步驟9同樣的操作，盡量去除上清殘液。
（16）利用塊狀加熱器（約65℃）等把沉淀干燥5分鐘。
（17）在干燥后的沉淀中添加適量的TE(pH 8.0)等，用渦流攪拌器混合。
（18）利用塊狀加熱器（約65℃），持續加溫3～5分鐘左右，利用渦流攪拌器攪拌，使沉淀完全溶解，制作成DNA試樣。

實施實例（方法）
使用DNA Extractor SP Kit，從正常人的血清（10檢查樣品）及血漿（1檢查樣品）中萃取DNA，對于溶解在20μl的TE（pH 8.0）的DNA試樣中的5μl（相當于25μl的血清或者血漿），進行p53-Exon5區域及p53-Exon7區域的PCR放大。各種反應中使用的底劑為NIPPONJIN公司的p53 Primers （Exon5：編號No. 312-03511, Exon7：編號No.316-03531）。而且，作為比較對照，使用了以多數的關于血液中游離DNA解析的文獻中使用的硅載體（離心過濾）法作為原理的A公司DNA精制試劑萃取的DNA，作為試樣添加了在1次的PCR中相當于25μl的血清或者血漿的DNA溶液。

（結果）
關于利用本試劑萃取的檢查樣品，在Exon5的PCR中可以確定所有的檢查樣品的放大斷片。在Exon7的PCR中，只有1個檢查樣品（檢查樣品編號③）沒有確定放大斷片，其余的均可以檢測出放大斷片。而且，結果，關于PCR擴大斷片的DNA量，在所有的檢查樣品中，對于利用本試劑萃取的DNA的擴大結果明顯比對于利用A公司的試劑萃取的DNA的擴大結果（得到粗帶），表示出本試劑的DNA萃取效率的高度。
關于Exon7的未能檢測出的檢查樣品，通過下述的實驗，在多少改變PCR條件進行再次試驗的結果，可以得到擴大的斷片。利用再次進行試驗得到的擴大斷片，可以顯示出即時從100μl的少量的檢查樣品中萃取時，從研究的所有的檢查樣品中可以進行p53遺傳因子的PCR擴大（向PCR供給的檢查樣品量相當于25μl）。

總結
根據此次的結果，作為DNA Extractor SP Kit的特征，可以顯示出“高DNA回收率”。可以認為高收率地得到血液中游離DNA與提高上述的患病相關的遺傳因子的檢測靈敏度與分析的精度相關聯，是一種有利于診斷方法開發研究的進步試劑。如果各位能夠對本試劑產生興趣，對各位的研究有所幫助，我將很高興。