4-硝基苯糖苷酶底物如何應用于比色法測定酶活性？

來源：作者：人氣：-發表時間：2017-11-28 12:58:00【大中小】

Megazyme 比色法用低聚糖 FAQs （1）

Q: 4-硝基苯糖苷酶底物如何應用于比色法測定酶活性？

A: 酶溶液稀釋: 將酶制劑稀釋到適當的分析緩沖液中(100 mM 0.1 mg/mL 牛血清白蛋白，在酶經檢測較佳pH范圍內)。初始的1:100稀釋液置于一個 100 mL容量瓶中，隨后加入10倍的稀釋液以獲得合適的酶溶液濃度。40攝氏度下，水浴加熱酶稀釋液5分鐘進行預培養。

加底物: 0.2 mL pNP底物 (10 mM)分別加入8個玻璃試管中(4個時間點的重復樣本)，40攝氏度水浴培養5分鐘。

酶反應: 0.2 mL酶(按步驟 4.23制備)分別加入含有底物的玻璃試管中，渦旋混合，并在40度水浴中培養重復樣本3，6，9，和12分鐘。在培養接近終點時，加入3.0 mL 2% 磷酸三鈉溶液以終止反應，并立即快速渦旋混合。

反應空白樣: 將3.0 mL 2% 磷酸三鈉加入2個玻璃試管中，然后加入0.2 mLpNP-底物 (10 mM)并渦旋混合，接著分別加入0.2 mL酶到2個試管中并立即渦旋混合。在室溫下培養。

在400nm下檢測所有樣品的吸光度

用水為分光光度計歸零。

檢測兩個空白樣 (記錄數值，然后根據其一將分光光度計歸零 – 設定這兩個值很接近).

檢測其余樣品的吸光度

根據吸光度和培養時間繪制吸光度曲線，并將結果用于計算。

計算:

1個單位酶活性，是每分鐘在較佳pH和40攝氏度下將1微摩爾PNP底物水解成pNP和底物所需要的酶的數量。

按以下公式進行計算:

U/mL = (A400 /按分鐘計的反應時間) x (按毫升計的總反應體積 / 按毫升計的酶溶液體積) x (1 / pNP的消光系數) x 酶稀釋因子

U/mL = (A400 / 分鐘) x (3.4 mL / 0.2 mL) x (1 / 18.1) x 稀釋因子

在這里:

A400/min = 吸光值 (反應)/分鐘 – 吸光值 (空白)/分鐘.

培養時間 = 10 min.

細胞總體積 = 3.4 mL

分析的等分體積 = 0.2 mL

2% 磷酸三鈉中pNP的消光系數 = 18.1

該計算設定,在記錄吸光度變化的整個10分鐘反應期內，反應速率呈線性分布。如果實際情況并非如此，則使用最高反應速率來替代2-10分鐘時間內記錄的速率


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