免疫印跡(Western Blotting)技術(shù)服務(wù)

來源：Seebio.cn作者：西寶生物人氣：-發(fā)表時間：2012-03-09 14:02:00【大中小】

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(western blot)，它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。western blot是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡(western blot)具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡(western blot)常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

我們?yōu)槟峁┤酌庖哂≯E(western blot)技術(shù)服務(wù)和相關(guān)的試劑耗材。主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1. 蛋白質(zhì)抽提

●實(shí)驗(yàn)對象為組織樣品，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。
●實(shí)驗(yàn)對象為細(xì)胞樣品（細(xì)胞培養(yǎng)），每份樣品取1×10⁶～1×10⁷細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。

2. 蛋白質(zhì)定量：按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。

3. 變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE):將準(zhǔn)備好的樣品液和預(yù)染蛋白marker分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)第一個孔中，電泳分離蛋白。

4. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過夜。

5. western blot膜的封閉和抗體孵育

A.膜在5％脫脂奶粉溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結(jié)合。
B.封閉過的膜加入一抗室溫孵育1.5小時，抗原抗體結(jié)合。
C.加入HRP標(biāo)記的二抗體以結(jié)合一抗，室溫孵育膜1小時。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時檢測GAPDH含量。

6. western blot結(jié)果檢測：化學(xué)發(fā)光法檢測，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用GIS1000分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數(shù)字化。

7. western blot數(shù)據(jù)分析：目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

8. 提供實(shí)驗(yàn)報告，包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù)。

western blot費(fèi)用：每張膜上做一種目的蛋白和相應(yīng)的內(nèi)參蛋白。每張膜上可做8個樣品。每張膜的費(fèi)用：1500.0元。一抗另計，其它試劑免費(fèi)，一抗訂購時間約為3周。

時間：約2－3周。

Western Blotting相關(guān)的試劑和耗材

產(chǎn)　品　名　稱	包　裝	單　價(RMB)
Trypsin-EDTA(胰酶EDTA)	0.25%,100ml	150.00
蛋白裂解液（蛋白提取液）	10ml	60.00
PMSF	100mM 10ml	86.00
40% Acr/Bis (37.5:1)	100ml	100.00
40% Acr/Bis (29:1)	100ml	100.00
40% Acr/Bis (19:1)	100ml	100.00
SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液	2x,1ml	28.00
SDS-PAGE電泳緩沖液	10x,500ml	100.00
蛋白膠快速染色液	100ml	120.00
蛋白轉(zhuǎn)移緩沖液	10x,500ml	100.00
可逆型轉(zhuǎn)移膜染色液	100ml	120.00
Tris-HCl Buffer,PH6.8(配濃縮膠）	0.5M, 250ml	100.00
Tris-HCl Buffer,PH8.8(配分離膠）	1.5M, 250ml	100.00
PBS buffer	20x,500ml	100.00
PBST buffer	20x,500ml	100.00
TBST buffer	20x,500ml	100.00
TBS buffer	20x,500ml	100.00
SDS	10%,100ml	100.00
洗脫抗體緩沖液(膜再生液）	100ml	100.00
二抗-HRP	0.2mg	175.00
預(yù)染Marker（20~120kDa）	250ul	200.00
ECL化學(xué)發(fā)光試劑	25ml	200.00
顯影液	250ml	45.00
定影液	250ml	45.00
硝酸纖維素膜NC膜	15cm*20cm	100.00
PVDF膜	13.5cm*15cm	100.00
3MM濾紙	27cm*1M	50.00
X線暗盒	5*7int.	600.00
柯達(dá)X光膠片	5*7int. 100/pk	200.00
乳膠手套	100/pk	65.00
PE薄膜手套	100/pk	5.00

原裝進(jìn)口標(biāo)簽蛋白單克隆抗體

標(biāo)簽蛋白（Tag protein）是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測、示蹤和純化等。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員相繼開發(fā)出了具有各種不同功能的蛋白標(biāo)簽。目前，這些蛋白標(biāo)簽已在基礎(chǔ)研究和商業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

標(biāo)簽蛋白抗體(Tag-antibody)可用于檢測各種商品化表達(dá)載體上的標(biāo)簽序列（如：DYKDDDDK, 6xHis, GFP, Myc，GST、HA等），籍以分析鑒定目的蛋白的表達(dá)含量及其功能。其原理是抗原—抗體反應(yīng)，這些標(biāo)簽抗體可以高度特異地結(jié)合對應(yīng)的標(biāo)簽融合蛋白，從而達(dá)到對相應(yīng)的標(biāo)簽融合表達(dá)對蛋白的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)定位，以及純化、定性或定量的研究。

本產(chǎn)品特點(diǎn)；

● 高敏感度 ● 高親和力 ● 低背景 ●高性價比

標(biāo)簽蛋白單克隆抗體 (DYKDDDDK=FLAG)

標(biāo)簽	描述(克隆號)	包裝
標(biāo)簽	描述(克隆號)	包裝
DYKDDDDK（FLAG）	Anti DYKDDDDK tag (1E6)	200ug;1mg;5mg
	Anti DYKDDDDK tag (1E6), HRP	100ul
	Anti DYKDDDDK tag (1E6), Antibody Beads	1ml; 5ml; 25ml
6xHis	Anti 6xHis (9F2) (C-terminal specific)	200ug
	Anti 6xHis (9F2), HRP (C-terminal specific)	100ul
	Anti 6xHis (9C11) (N?C-terminal)	200ug
	Anti 6xHis (9C11), HRP (N?C-terminal)	100ul
	Anti 6xHis (21-48) (N?C-terminal)	200ug
	Anti 6xHis (28-75) (N?C-terminal)	200ug
	Anti 6xHis (48-75), Antibody Beads	1ml; 5ml
GFP	Anti GFP (mFX73) (for IP and IHC)	100ul, 100ul*5
GFP	Anti GFP (mFX75) (for Western Blotting)	200ug
GST	Anti GST (5A7)	200ug
GST	Anti GST (5A7), HRP	100ul
c-Myc	Anti c-Myc (9E10)	200ug
	Anti c-Myc (9E10), HRP	100ul
	Anti c-Myc (9E10), Antibody Beads	1ml; 5ml
HA	Anti HA, mAb (4B2)	200ug
	Anti HA, mAb (4B2), HRP	100ug
	Anti HA (4B2) Antibody Beads	1ml; 5ml