熒光定量PCR檢測技術從誕生到現在已經有 8 年了，但是其應用在近四年才迅猛增長。在 Medline 數據庫中，用“ Taqman” 或 ”real time PCR” 作為關鍵詞檢索，在1996 年僅有 19 篇，在 1997 年僅有 28 篇，在 98 、 99 、2000 年分別達到了 52 、 157 、 409 篇， 2003 年已經達到2984 篇，相信在不久的將來會有更多的文章發表。針對實時 PCR 這一熱點領域，我們對它進行了深入細致的研究，并且及時地為廣大科研人員推出這項技術服務。

熒光定量PCR基本原理
Taqman 技術：該技術以美國 ABI 公司為代表。 PCR 擴增時，在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收， PCR 儀檢測不到熒光信號； PCR 擴增時（在延伸階段）， Taq 酶的 5' － 3' 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與 PCR 產物形成同步，這也是定量的基礎所在。

Beacon 技術：該技術以美國人 Tagyi 為代表。也是加入了熒光探針，但它是環狀的寡核苷酸探針，分別由莖部和環部組成， 兩端分別標記 熒光報告基團和熒光猝滅基團，在無靶序列的情況下，探針始終是環狀，報告基團的熒光被猝滅基團猝滅，使熒光檢測儀檢測不到熒光信號；而在有靶序列時，即在 PCR 的退火階段探針與靶序列結合，使熒光報告基團和猝滅基團分開，這樣熒光儀可以檢測到熒光，熒光信號的強弱代表了靶序列的多少。

FRET 技術：該技術以 Roche( 羅氏公司 ) 為代表。它的基本原理是：兩條直線型寡核苷酸探針，其中一條的 3 ‘端標記熒光激發基團，另一條的 5 ' 端標記熒光檢測基團，在無靶序列的情況下，兩條探針分開，無法進行能量的傳遞，這樣熒光儀不能檢測到熒光信號；而當有靶序列時，即在 PCR 的退火階段兩條探針與靶序列結合，使得兩條探針上的熒光基團可以進行能量的傳遞，這樣熒光儀就可以檢測到熒光信號，熒光信號的強弱代表了靶序列的多少。

實時熒光定量PCR中的幾個俗語
?  Ct 值：是指每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。
?  熒光域值（ threshold ）：是指 PCR 反應的前 15 個循環的熒光信號，熒光域值的缺省設置是 3-15 個循環的熒光信號的標準偏差的 10 倍，即： threshold.
?  Ct 值與起始模板的關系：研究表明，每個模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系〔 1 〕，起始拷貝數越多， Ct 值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代 Ct 值。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

熒光定量PCR應用廣泛
?  可以對各種基因的表達進行定量分析，如：同一基因在不同組織中的表達差異、同一基因在不同藥物處理后的表達差異、轉基因食品的檢測。過去常用的高通量篩選基因表達差異的技術是 cDNA 芯片和差異顯示，但這兩種技術的缺點是只能定性而非完整意義上的定量分析。實時 PCR 技術和高通道實時 PCR 儀的出現，無疑為這種檢測提供了極大的方便。
?  可以進行點突變分析和等位基因分析，用不同的熒光報告基團標記 Taqman 探針，然后分別與野生型和突變型雜交，如果一種熒光信號明顯強于另一種熒光信號，則表明它是純合子；如果兩種熒光信號都明顯增強，則表明它是雜合子。另外分子信標（ Molecular Beacon ）就是專門為這種技術設計的探針。
?  可以進行單核苷酸多態性的分析，檢測單核苷酸多態性對于研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應有著重要的意義，因分子信標結構的巧妙性，一旦 SNP 的序列信息是已知的，采用這種技術進行高通量的 SNP 檢測將會變得簡單而準確。
?  可以進行 DNA 甲基化檢測， DNA 甲基化同人類的許多疾病有關，特別是癌癥， Laird 報道了一種稱作 Methylight 的技術，在擴增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman 探針來區分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。
?  對傳染性疾病進行定量定性分析，這在我國應用比較廣泛，大家比較熟悉。許多生產臨床 PCR 試劑的廠商已經陸續推出了一系列的診斷試劑，如：肝炎系列、性病系列、腫瘤系列等等。

熒光定量PCR技術服務
熒光定量PCR用Taqman 方法對 DNA/RNA 進行 real time PCR 的定量測定或型的鑒定。

熒光定量PCR服務要求
1. 請您提供新鮮的且盡量多的材料（各種材料的 RNA 提取量請參照“總 RNA 的提取”），或直接提供純化好的 總 RNA （大于 5 ug/ 樣品）；（ 各種材料的 DNA 提取量請參照“ DNA 的提取”），或直接提供純化好的 DNA （大于 5 ug/ 樣品 ) 。
2. 請通過 E-mail 提供已知的全長基因序列。
3. 請提供盡可能詳細的背景資料： DNA/ RNA 來源、豐度等

熒光定量PCR操作程序
1. 根據基因序列設計特異性的引物和熒光探針。
2. 提取 DNA/RNA 。
3. Real Time PCR(熒光定量PCR)，進行實驗結果分析
4. 實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結果）及引物等實驗材料

熒光定量PCR收費標準:
1、RNA提取：10－20個樣品的RNA提取是：150元/個；20－30個樣品的RNA提取是：120 元/個；30個以上樣品的RNA提取是：100元/個；每份材料應提供：100mg/樣品
2、一個指標每個樣品為150元；二個指標每個樣品為240元；三指標每個樣品為300元，三個指標以上每個樣品為80元/反應。
3、引物合成為每個堿基2.1元，探針標記為1200元/條，如果是用sybr green I(染料)做，則免去探針的費用，染料贈送。
4、內參的GAPDH引物探針免費，標準曲線免費贈送。
5、不再收取任何的基礎費或者開機費。

(如果樣本或者指標數更多，再面議)

時間：接到樣品后1個月內完成！
提供樣本：用干冰運輸，樣品重量在100mg左右；上海的用戶可以上門取標本。
技術部免費設計引物探針，客戶只需提供標本和genebank的ID號或者告訴我們指標的名稱。

MicroRNA(miRNA)熒光定量PCR技術服務！

一、什么是miRNA?
MicroRNAs (miRNAs)是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關。據推測，這些非編碼小分子RNA（miRNAs）參與調控基因表達，但其機制區別于siRNA介導的mRNA降解。第一個被確認的miRNA是在線蟲中首次發現的lin-4 和let-7，隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數百個miRN As 。

二、miRNA是如何產生的？

miRNAs 是轉錄后長片段的 RNA 分子（ pri-miRNA ）的一部分，首先在細胞核內被雙鏈 RNA 特異的核酸酶Drosha 處理成為 70-100 個核苷酸組成的發夾結構 RNA （ pre-miRNA ）。這一發夾結構 RNA 運輸到細胞質，被另一個雙鏈 RNA 特異的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 個 核苷酸組成的成熟的 miRNA ，結合在與 RNA 介導的沉默復合物（ RISC ）類似或者相同的復合物中，這個復合物參與了 RNA 干擾。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的堿基配對引導 RISC 降解目的片段或是阻礙其翻譯過程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互補的堿基配對決定了這個過程的特異性。通過抑制翻譯還是降解發揮作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之間的錯配程度決定的，匹配程度高的目的 mRNA 將被降解。由于 miRNAs 可以對不完全互補的 mRNA 配對來抑制蛋白質的翻譯過程，因而每個 miRNA 可以有多個靶基因，而幾個 miRNAs 可以調節同一個基因。這種復雜的調節網絡既可以通過一個 miRNA 來經濟地調控多個基因的表達，也可以通過幾個 miRNAs 的組合來精細調控某個基因的表達。對于基于 miRNA 調控基因表達的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復雜性和復雜的基因表達調控網絡。

三、miRNA熒光定量PCR基本原理
實時熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光試劑，利用熒光信號實時檢測PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR能夠專一、靈敏、快速、高重復性地精確定量起始模板濃度。但是就成熟的microRNA而言，由于其是由21-25個核苷酸組成的小RNA，長度太短，并不能通過傳統的實時定量PCR進行檢測,但是通過特殊設計的莖環結構的反轉錄引物，配合實時定量PCR引物及探針可以精確檢測微量樣品中microRNA表達水平，也可以用終點PCR法定性檢測。

雖然 microRNA 實時定量PCR是一種近來才發展起來的檢測技術，其技術細節還在不斷完善中,但是microRNA 實時定量PCR檢測系統，相對其它microRNA檢測技術有以下優點：
1.高特異性 , 可以只對成熟 microRNA 進行定量，有效區分成熟 microRNA 分子和前體分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子；
2.快速，簡單，省時，整個操作只需兩步，不到 3 個小時，即可獲得高質量的數據；
3.檢測靈敏度高，樣品消耗少，僅需 1-10ng 的總 RNA 或 50pg 左右的 microRNA ；
4.超寬的線性范圍，可跨越 7 個數量級；

四、miRNA序列在線查找
http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/  

官網：www.baichuan365.com	微信服務號：iseebio	微博：seebiobiotech

商城：mall.seebio.cn	微信訂閱號：seebiotech	泉養堂：www.canmedo.com