多肽合成技術服務

合成原理
當前化學合成多肽的方法主要有兩種，即 Fmoc 和 t Boc ；由于 Fmoc 比 tBoc 存在更多優勢，所以現在較流行的是 Fmoc 法。多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，合成方向是從 C 端（羧基端）向 N 端（氨基端）進行；過去多肽合成大多是在液相中進行，現在大多采用固相合成，從而大大的降低了每步產品提純的難度；為了防止副反應的發生，合成柱和添加的氨基酸的側鏈都是預先被保護的，只有羧基端是游離的，并且在反應之前必須先用化學試劑活化它。
具體合成步驟如下：
1 、去保護： Fmoc 保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（ piperidine ）去除氨基的保護基團。（如圖 1 ）
2 、激活和交聯：下一個氨基酸的羧基被一種激活劑所激活溶解，激活的單體與游離的氨基在交聯劑的作用下交聯，形成肽鍵。（如圖 2 ）
3 、循環：這兩步反應反復循環直到整條肽鏈合成完畢。
4 、洗脫和脫保護：根據肽鏈所含的殘基不同，用不同的脫樹脂溶劑從柱上洗脫下來，其保護基團被一種脫保護劑（ TFA ）洗脫和脫保護。

肽鏈的設計

簡介
多肽是復雜的大分子 , 因此每條序列在物理和化學特性上都是獨特的，有些多肽合成很困難 , 另有些多肽雖然合成相對容易 , 但純化困難；常見的問題是許多肽不溶于水溶液 , 因此在純化中 , 這些疏水肽必須溶于非水溶劑中或特殊的緩沖液 , 而這些溶劑或緩沖液很可能不適合應用于生物實驗系統 , 因此研究人員不能使用該多肽達到自己的目的 , 因此下面是對于研究人員設計多肽的一些建議。
如何降低肽鏈合成的難度？
1. 減少序列長度
  　由于肽的長度增加會導致粗產物純度降低 , 小于 15 個殘基的肽比較容易得到較高純度的初產物，當肽鏈長度增加到 20 個殘基以上時 , 正確產物的量就是一個主要考慮的問題。在許多實驗中 , 降低殘基數低于 20 往往能得到更好的實驗結果。
2. 減少疏水性殘基數
  　疏水性殘基占明顯優勢的肽，尤其在距 C 端 7-12 個殘基的區域，常常引起合成困難。這通常被認為是由于合成中形成 b 折疊片，這樣會產生不完全配對。用 1 個或幾個極性殘基置換 或加入 Gly 或 Pro 以打開肽結構可能會有幫助。
3. 減少“困難”殘基
  　有多個 Cys 、 Met 、 Arg 、 Try 殘基通常難于合成。 Ser 通常可作為 Cys 的非氧化替換。
如何增強肽鏈的可溶性？
?  改變 N 端或 C 端
對于酸性肽 ( 即 pH 值為 7 時帶負電荷 ), 我們推薦乙酰化 (N 端乙酰化 , C 端保持自由羧基 ), 以增加負電荷。而對于堿性肽 ( 即 pH 值為 7 時帶正電荷 ), 我們推薦氨基化 (N 端自由氨基 , C 端氨基化 ), 以增加正電荷。
?  縮短或加長序列
某些序列含有大量疏水氨基酸 , 如 Trp 、 Phe 、 Val 、 Ile 、 Leu 、 Met 、 Tyr 和 Ala 等 , 當這些疏水殘基大于 50% 通常難于溶解。為了增加肽的極性 , 加長序列可能會有幫助。另外一種選擇是通過減少疏水殘基的方法降低肽鏈的長度以增加極性。肽鏈極性越高 , 就越有可能溶于水。
?  加入可溶性殘基
對于某些肽鏈而言 , 加上一些極性氨基酸能改善可溶性。我們推薦給酸性肽的 N 端或 C 端加上 Glu-Glu 。給堿性肽的 N 端或 C 端加上 Lys-Lys 。如果不能加入帶電荷基團 , 可以將 Ser-Gly-Ser 加到 N 端或 C 端。但是 , 肽鏈的兩端不能改變時 , 該方法則不可行。
?  通過置換一個或多個殘基改變序列
肽鏈的可溶性可通過改變序列內某些殘基來改善。通常單個殘基的替換就能顯著改善其疏水性 , 而這種改變通常是較為保守的 , 如用 Gly 代替 Ala 。
?  通過選用不同 “ 框架 ” 來改變序列
如果能用某個序列來制備許多長度一定的相互串連或重疊的多肽 , 則可以用改變各個多肽起始點的方法來實現改變序列的目的。其原理是 : 在同一多肽的親水和疏水殘基間創造新的更好的平衡 , 或將同一多肽內的 “ 困難 ” 殘基 ( 比如 2 個 Cys) 放進兩個不同的多肽而不是集于同一分子內。
特殊氨基酸殘基對肽鏈特性影響的一些要點
對于由遺傳密碼編碼的二十種氨基酸及蛋白質中常見的其他氨基酸 , 按其特性可以用幾種方法進行分類。下面列出了常見的氨基酸的三字母代碼和單字母代碼，以及不同的分類方法。

氨基酸的代碼

蛋白質中常見的其他氨基酸

肽鏈設計中常見的其它氨基酸
α- 氨基丁酸 (Cys 的置換物 )
β- 氨基丙氨酸 (Ala 的直鏈異構物 )
正亮氨酸 ( 亮氨酸的線性側鏈異構物 )

氨基酸按其親水性、疏水性分類
親水性氨基酸 : D, E, H, K, Q, R, S, T, 羥脯氨酸 , 焦谷氨酸
疏水性氨基酸 : A, F, I, L, M, P, V, W, Y, α- 氨基丁酸 , β- 氨基丙氨酸 , 正亮氨酸
C 和 G 屬于未定類

其它的分類方法
在溫和條件下氧化的氨基酸 -->C, M
脫氨或脫羧基的氨基酸 -->N, Q
蛋白制備中易降解的氨基酸 -->M, W
帶正電荷的氨基酸 -->K, R, H
帶負電荷的氨基酸 -->D, E

　　當下列疏水氨基酸 , 即 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp 存在于 C 端時 , 通常引起合成及純化的困難 , 這主要是因為它們難溶于水。如果您看見這些氨基酸 , 即 Cys 、 His 、 Pro 普遍存在于序列中或在 C 端時 , 則在常規的固相合成中需要特殊的固相支持物。在用普通的固相支持物時 , 在二肽階段 , 由于環化引起的損失非常高。在許多例子中 , 甚至導致所有鏈從固相支持物上損失 , 但是若 C 端為氨基化 Pro 時 , 或者用特殊的 PEG- 聚苯乙烯固相支持物時 , 能使產量大為提高 , 則不會發生這種現象。

多肽保存
　　 凍干多肽可 -20℃保存或室溫保存；溶液肽遠比凍干形式不穩定，溶液應為中性 pH(pH5-7),-20℃保存的；為避免樣品的反復凍融，建議分成小樣存放。一份樣品如果凍融后未用完，應扔掉不再使用，因為細菌的降解有時會成為溶液肽的麻煩，所以多肽應溶于無菌水或多肽溶液用 0.2μ M 濾膜過濾后保存。
　　 對于含 Cys, Met orTrP 的多肽，脫氧緩沖劑對其溶解必不可少，因為這種多肽極易被空氣氧化，建議用惰性氣體填充保存。另外含 Gln 或 Asn 的多肽也容易降解。

多肽溶解
　　 大多數多肽的首選溶劑是超純抽氣水；稀乙酸或氨水分別對堿性或酸性多肽的溶解也很有幫助。如果這些方法度過后還不溶的多肽，建議用 DMF 、脲、 guanidiniam chloride 或 acetonitnle 來溶解，但這些溶劑可能對某些實驗有副作用，所以我們建議設計多肽時要多加留意，如殘基 Ala 、 Cys 、 Ile 、 Leu 、 Met 、 Phe 和 Val 都會增加多肽的溶解難度。

多肽HPLC分析和純化
　　 HPLC 分析柱有兩類：離子交換柱和反相柱。離子交換 HPLC 依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用，柱子在一定 PH 范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現出相反電荷，分離是一種電荷相互作用，通過改變 PH 值、 離子強度，達到分離純化的效果。通常，先用低離子強度的溶液，以后逐漸加強或一步一步加強，直到多肽從柱中洗脫出。
　　 反相 HPLC 條件與正常層析正相反，多肽通過疏水作用連到柱上，用降低離子強度洗脫， 如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成，這種鏈長度為 G4-G8 碳原子。 由于洗脫是一種疏水作用。長鏈柱比短鏈對小的，高帶電肽好；另一方面大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。
　　 典型的操作常由兩綬沖劑組成， 0.1%TFA-H2o 和 80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o 稀 acetonitrile 。用線型梯變以每分鐘 0.5% 到 1.0% 改變的速度混合。常見分析和純化用柱為 4.6×250mm(3-10μ m) 和 22×250mm(10μ m). 如果用徑向填柱，那么大小是 8×100 （ 3-10μ m ）和 25×250mm(10μ m)
　　 大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如 heptafluorobutyric 酸， 0.1% 磷酸， 稀 Heformic 酸 (5-6%, pH2-4), 10-100mMNH4HCO3, 醋酸鈉 / 氨， TFA/TEA ，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意一點：硅反相柱料不能長時間暴露于高 pH ，甚至微堿 pH ， 因為這樣會破壞柱子。

多肽合成服務價格（大宗用戶價格面議）

用途
主要用于抗體的制備、多肽疫苗、多肽微注射及對基因結構與功能關系的研究。

說明
?  多肽合成價格原則上以每個氨基酸殘基數計，“aa”代表“ 氨基酸殘基 ”；含有特殊結構的肽鏈或aa ，如 -(-S-S-)- 、非天然 aa 、修飾 aa 等，價格需要協商。
?  上述價格為參考價，確定的價格視多肽序列將作上、下變動，其中少于 6 個 aa 的 按 6 個 aa 計算。
?  可為客戶免費進行 C18 脫鹽純化，但大多數用于抗體制備的多肽都可以不必特殊純化（ HPLC ）。
?  發貨時間一般為 4 周，具體情況應視序列長短、合成的難易及純化的難易，再與客戶協商。
?  請在訂單中寫明多肽序列、數量、純度及特殊要求。
?  我們生產的多肽產品都提供相應的純度分析圖（ HPLC ）如果需要做分子量鑒定，可進一步做質譜圖。

注：制備多肽的一個很大用途是制備多肽抗體，但因多肽的分子量相對較小，所以免疫原性較差，人們通常用BSA或者KLH與之偶連，但這種方法比較傳統也不方便，我們推出MAP多肽，即在合成多肽時，C端偶連上MAP，而MAP是沒有免疫原性的Lys結構,即在MAP上可以形成4個或8個抗原性多肽。multiple antigenic peptide結構如下圖：我們同時免費提供抗原設計服務

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