內源性AMPA型谷氨酸受體（AMPAR）活細胞成像試劑 - LiveReceptor AMPAR
內源性AMPA型谷氨酸受體（AMPAR）活細胞成像試劑LiveReceptor AMPAR
LiveReceptor AMPAR是一種可以在活細胞中對AMPA型谷氨酸受體（AMPA Receptor; AMPAR）進行特異性熒光標記的蛋白標記試劑。由于它能在活細胞中對內源性AMPAR進行標記，所以通過活細胞成像技術對生理性AMPAR進行行為分析的能力十分優秀。
※ 本產品是Funakoshi株式會社基于京都大學工學研究科 浜地教授的研究成果商品化而成。
※ 本產品僅供研究，研究以外不可使用。
添加LiveReceptor AMPAR至初代培養海馬神經細胞進行培養后，可用熒光素對內源性AMPAR進行標記。使用LiveReceptor AMPAR，可使活神經細胞中的AMPAR可視化。
◆關于受體活細胞成像方法的問題以及配體指向性蛋白標記
■ 傳統受體的成像方法及問題
配體指向性蛋白標記
為了克服過往的問題，京都大學工學研究科的浜地教授與清中準教授等人，確立了一項技術，利用蛋白表面反應基團?；溥颍╝cyl imidazole）僅對內源性目標受體蛋白進行熒光標記（圖下半部分）。該方法只有在特異性配體與目標受體蛋白結合時，激活蛋白表面的反應基團?；溥颍梢赃x擇性對目標受體蛋白進行熒光標記。由于接下來更換培養基可以去除多余配體和反應片段，因此可以觀察到配體結合部位呈現空余狀態的生理性受體蛋白行為。
參考文獻：
1. Fujishima, et al., J. Am. Chem. Soc., 134, 3961～3964 (2012).
2. Miki, et al., Chem. Biol., 21, 1013～1022 (2014).
■ LiveReceptor AMPAR
LiveReceptor是以神經遞質受體為目標的配體指向性蛋白標記試劑。LiveReceptor AMPAR是AMPA型谷氨酸受體（AMPAR）特異性熒光標記試劑1。它對闡明在記憶分子機制中發揮核心作用的AMPAR行為分析有用，并且作為腦神經基礎研究為首的神經、精神疾病研究等治療藥物開發的優越試劑備受期待。
參考文獻
1. Wakayama, et al., Nat. Commun., 8, 14850 (2017). [PMID : 28387242 ]Chemical labeling for visualizing native AMPA receptors in live neurons.
※ LiveReceptor AMPAR為文獻中的CAM(FI)。
◆特點
● 可以在內源性AMPAR標記熒光素。
● AMPAR(Glu2-4亞單位)特異性高*，不會標記其他離子通道谷氨酸受體（NMDA行谷氨酸受體、海藻酸谷氨酸受體）。
● 添加培養基， 1~4小時的標記反應后，便可進行AMPAR實時成像。
● 由于沒有膜滲透性，因此僅可標記細胞表面的AMPAR。
● 在過量表達培養神經細胞、培養大腦切片組織以及AMPAR（GluA2、GluA3A或者GluA4亞基）的細胞系上有應用案例。
● 由于是小分子，組織滲透性高，在腦組織急性切片上有可以標記至深部的應用案例。
● 經電生理學方法確認，標記后的AMPAR仍然保持離子通道功能。
● 推薦使用濃度1 μM，這個濃度下幾乎沒有細胞毒性。
● 由于使用熒光素用作熒光色素，所以有pH反應，并且內部化的標記AMPAR趨于淬滅。因此適于觀察細胞表面的AMPAR。
● 以活細胞成像為首，可用于各種應用。詳情請瀏覽下文應用實例
*由于不會標記GluA1亞基，所以不能使GluA1同聚物可視化。
◆應用
● 活細胞成像
● Western blot（抗熒光素抗體）
● 通過免疫沉淀（抗熒光素抗體）對AMPAR結合蛋白進行分析、研究
● 免疫染色（可以與抗其他因子的抗體進行共染色）
● 拮抗型抑制物質的探索以及活性評價
◆應用實例
神經細胞的活體成像
添加1 μM LiveReceptor AMPAR及熒光標記配體（FL-ligand；陰性對照）至原代海馬神經細胞中培養30 min，換液后進行實時成像。熒光標記配體無法觀察神經細胞的形態；與之相反，使用LiveReceptor AMPAR可以觀察到神經細胞的形態以及樹突棘結構。
培養切片組織的實時成像
海馬的培養切片組織中，分別在含有和不含AMPAR特異性拮抗阻遏物NBQX（10 μM）的情況下，添加Live Receptor AMPAR（1 μM）。培養1小時，換液后進行實時成像。
不含NBQX（左）：可觀察到樹突棘結構的熒光信號。
含有AMPAR特異性阻遏物NBQX（右）：熒光信號消失。
結果顯示，NBQX與 AMPAR配體的結合部位相互競爭，以及LiveReceptor AMPAR的熒光信號是AMPAR特異性的。
AMPAR特異性
A：特異性驗證
用LiveReceptor AMPAR導入熒光素后，裂解細胞，以抗熒光素抗體（anti-FL）進行Western blot進行檢測，獲得了相當于AMPAR的GluA2亞基的105 kDa的單條帶。從該條帶AMPAR特異性抑制物質NBQX消失來判斷AMPAR特異性。
B：利用免疫沉淀證明其特異性
為鑒定通過LiveReceptor AMPAR 進行熒光素標記的蛋白，不使用抗熒光素抗體（anti-FL）進行免疫沉淀，而是使用對各谷氨酸受體亞基的特異性抗體進行Western blot。結果只發現AMPA型谷氨酸受體的亞基GluA2濃縮，其余GluN（NMDA型谷氨酸受體：NMDAR）和GluK（海藻酸型谷氨酸受體：KAR）并未發現免疫沉淀引起的濃縮。
C：利用免疫染色比較抗GluA抗體染色圖像
利用LiveReceptor AMPAR在活細胞進行熒光素標記后，固定細胞，使用抗GluA2抗體進行免疫染色?？梢园l現，LiveReceptor AMPAR的染色圖像和使用了抗GluA2抗體的染色圖像基本一致。
觀察組織深部
將切片培養的小鼠大腦使用LiveReceptor AMPAR標記后，固定組織，以抗GluA2/3抗體進行免疫染色。x-y平面圖像中，二者基本一致，但是從黃線部分的x-z斷面可以發現，抗體組織滲透性低，只能染色切片表面。然而因為LiveReceptor AMPAR滲透到了組織深處，所以能夠標記組織深層的AMPAR。（黑箭頭：切片上端，白箭頭：切片下端）。
通過FRAP分析行為分析AMPAR
用LiveReceptor AMPAR標記神經細胞內源性AMPAR并通過FRAP（Fluorescence recovery after photobleaching）法分析細胞膜上的AMPAR運輸速度?？捎^察到熒光迅速恢復的情況。
Recovery ratio：16%，diffusion coefficient：0.090 μm2s-1
利用藥劑處理觀察突觸可塑性
使用LiveReceptor AMPAR標記培養海馬神經細胞后，用NMDA（50 μM）處理10 min并使用化學性LTD（Long-term depression；長時程抑制）誘導。在LTD誘導條件下，可觀察到樹突棘中標記AMPAR的數量明顯減少。
拮抗抑制物質探索性篩選
A：由于LiveReceptor AMPAR使用AMPAR特異性配體進行標記，因此可用于探索與AMPAR配體拮抗的抑制物質和拮抗劑（competitive antagonist）。可在細胞、組織中確認，LiveReceptor的標記顯著收到AMPAR特異性抑制物質NBQX抑制。
B上部分：AMPAR大量表達細胞，B下部分：組織
| 產品編號 | 產品名稱 | 產品規格 | 產品等級 |
| FDV-0018A | LiveReceptor AMPAR | 10 μg | -20°C |
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| 官網：www.baichuan365.com | 微信服務號：iseebio | 微博：seebiobiotech |
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| 商城：mall.seebio.cn | 微信訂閱號：seebiotech | 泉養堂：www.canmedo.com |
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