Controllable NOdonor

來源：作者：人氣：-發表時間：2023-08-15 13:40:00【大中小】

Controllable NOdonor<NO-Rosa5>

在任意范圍、時間通過可視光照射釋放NO的試劑

Controllable NOdonor<NO-Rosa5>是通過黃綠色可視光（530~590 nm）的照射釋放出一氧化氮（Nitric oxide，NO）的Photo-controllable NO donor。利用光毒性低的可視光照射可以在時間空間上控制NO的釋放，有利于各種細胞內信號傳輸相關的NO生理現象研究。

※本產品僅供科研使用。

※本產品基于名古屋市立大學的中川秀彥教授的研究成果商品化而成。

◆Memo

關于NO研究中Photo-controllable NO donor的意義及問題點

雖然一氧化氮是分子量僅有30的氣體分子，但是在生物體內作為信號傳輸物質而發揮作用，因此闡明其生理意義是一項重要的課題。下文闡述了一些與NO研究相關的生理現象。

●　血管舒張（vasodilation）

●　神經傳輸（neurotransmission）

●　血小板黏附（platelet adhesion）

●　炎癥反應（inflammation）

NO的氣體分子是通過生物體內的NO合成酶產生，但在生理條件下極其不穩定，半衰期約為幾秒左右。因此，NO被認為是在生物體內產生后，僅在狹小的范圍（<100 μm）內起作用的局部信號傳輸物質，因此，期待能夠闡明NO作為媒介參與的局部信號傳輸的意義。然而，由于NO是不穩定的氣體分子，難以用于實驗中，于是NO donor便被用于驗證NO生理效果。

NO donor是在水溶液中分解，并緩慢釋放NO的化合物群的總稱。不同NO釋放效率以及半衰期各異的化合物被開發成各種產品。然而，使用以前的NO釋放劑，會使實驗溶液均一地釋放出NO，導致很難觀察到原來的NO作用于局部的瞬時效果。為了解決該問題，近年來已開發出幾種光反應性的NO donor如“Photo-controllable NO donor”，1）需要UV光的試劑類，或2）主要使用金屬絡合物的試劑類，但無論哪種都有難以適用于活細胞實驗的缺點（參照表格）。

名古屋市立大學的中川秀彥教授等人克服了至今的問題，成功開發出不含金屬絡合物，毒性低且能在時間空間上控制NO釋放，并通過可視光控制的Photo-controllable NO donor——NO-Rosa5（Controllable NOdonor）。使用本產品，可以在任意時間以及任意局部控制NO釋放，作為研究NO的新工具而備受期待。

	普通NO donor	Photo-controllable NO donor
	普通NO donor	UV光控型 CNO-4,BNN5等	金屬絡合物	Controllable Nodonor （NO-Rosa5）
NO釋放原理	自發性分解	光分解后自發分解	光分解	光分解
光照	——	UV光	可視光、近紅外光	可視光
光照	——	（~300 nm）	可視光、近紅外光	（530~590 nm）
時間控制	困難	可以	可以	可以
空間控制	不可以	可以	可以	可以
光毒性	——	毒性極高	毒性低	毒性低
化合物的細胞毒性	與化合物有關	低	高（金屬毒性）	低

◆參考文獻

1.	Ieda, et al., Sci. Rep., 9, 1430, (2019) ,"Structure-efficiency relationship of photoinduced electron transfer-triggered nitric oxide releasers."
2.	Ieda, et al., Chem. Pharm. Bull., 67, 576～579 (2019), "In cellullo and ex vivo availability of yellowish-green-light-controllable NO releaser."
3.	Okuno, et al., Org. Biomol. Chem., 15, 2791～2796 (2017), "A yellowish-green-light-controllable nitric oxide donor based on N-nitrosoaminophenol applicable for photocontrolled vasodilation."

◆原理

本試劑將Rosamine色素骨架用作光吸收天線，在吸收黃綠色光（530~590 nm）時，誘導光致電子轉移(PeT: Photoinduced electron Transfer)，釋放出NO。

◆特點

●　通過黃綠色光（530~590 nm；最大吸收λmax～560 nm）引發NO釋放。

●　非光照射時，NO釋放量被抑制在極其微小的程度^*1。

●　推薦使用濃度10 μM，未發現細胞毒性。

●　已驗證了在培養細胞系，ex vivo主動脈血管舒張實驗中的生物活性。

●　已證實顯微鏡的543 nm射線（He- Ne射線）以及氙燈可作為光源使用。

*1 請務必注意實驗中的環境光線。

◆操作方法概要

※以下實驗步驟僅供參考。請根據具體實驗目的進行探討。

1.　制備含有Controllable NOdonor的培養基

2.　去除培養基

3.　更換含有Controllable NOdonor的培養基^*2

4.　培養30分鐘以上

5.　在任意時間、部位進行光照，然后進行各種成像^*3 或生化學分析

*2 也可不更換培養基，直接添加Controllable NOdonor。

*3 各種成像中使用熒光物質作為檢測系統時，需要注意熒光物質的選擇。詳見下文中的“實驗指導”。

實驗注意

本產品有可能因實驗環境的光線（室內熒光燈或陽光）分解，釋放出NO。在制備溶液以及進行實驗時盡量保持避光。

◆應用實例

■　通過NO電極定量NO釋放活性

作為in vivo NO釋放模型，用黃綠色光（530~590 nm帶通濾波器）照射含10 μM Controllable NOdonor、100 mM HEPES（pH7.3）、0.1% DMSO的溶液，通過NO電極定量釋放的游離NO濃度。連續300秒照射時，最大可觀察到4 μM的NO（左）。照射時間每20秒脈沖一次時，則可觀察到階段性的NO釋放。隨著試劑消耗，NO的釋放量也逐漸減少（右）。

■　使用NO檢測試劑實現NO釋放活性可視化

用綠色熒光NO檢測試劑DAF-FM（10 μM）前處理HEK293T細胞30分鐘后，用PBS清洗細胞，在添加Controllable NOdonor的條件下培養30分鐘。使用NO檢測試劑DAF-FM的熒光強度觀察氙氣光源（帶通濾波器 530~590 nm）照射前后細胞內的NO量。由于光照后DAF-FM的熒光強度顯著增強，可以看出通過光照促使NO釋放。

■　通過局部的光照使特定部位釋放NO

用熒光NO檢測試劑DAF-FM DA（10 μM）前處理HEK293T細胞30分鐘后，用PBS清洗細胞，在添加Controllable NOdonor的條件下培養60分鐘。使用共聚焦顯微鏡的543 nm射線光照白圈部分（直徑31 μm），通過DAF-FM檢測NO的釋放。可以確認僅白圈部分釋放出NO。使用本試劑，可通過光在時間空間上控制NO的釋放。

■　ex vivo 血管舒張實驗

將分離的大鼠主動脈切片浸于填滿Krebs緩沖液的Magnus 試管中，并添加抑制內源性NO產生的NO合成酶抑制劑L-NAME（100 μM）。接著，添加去甲腎上腺素（10 μM）使血管進入收縮狀態。即使用綠光（530~590 nm）照射3分鐘，也未發現光自身對血管收縮有效果（圖中①）。但添加Controllable NOdonor（10 μM）后照射綠光則可觀察到明顯的血管舒張（圖中②④）。停止光照后，再次發現血管收縮（圖中③⑤）。雖然sGC（soluble guanylyl cyclase）-cGMP路徑參與NO引起的血管舒張，但在該狀態下添加sGC抑制劑ODQ（10 μM）的話，綠光照射也能抑制血管擴張（圖中⑥）。實驗結果可以看出使用Controllable NOdonor通過光照能夠控制血管舒張。