CAS Number: 60842-46-8
化學(xué)名稱：
·Dextran(3’,6’-dihyroxy-3-Oxospiro (isobenzofuran-1-(3H), 9'-[9Hxanthen]-5 (or 6)-ylcarbamothiate.
·Fluoresceinisothiocyanate-dextran
· Fluoresceinyl thiocarbamoyl-dextran

FITC標(biāo)記葡聚糖是由熒光素異硫氰酸酯(5-異構(gòu)體)與相應(yīng)的葡聚糖偶聯(lián)合成的?？刂泼總€(gè)批次的分子量，取代度，干燥失重和游離FITC。TdB生產(chǎn)分子量4kDa到20kDa的FITC標(biāo)記葡聚糖。FITC標(biāo)記葡聚糖是黃色至橙色粉末，易溶于水或鹽溶液，呈黃色溶液。該產(chǎn)品也可以溶于DMSO, 甲酰胺和其它極性有機(jī)溶劑，但在低級(jí)脂肪醇，丙酮，氯仿和DMF中基本不溶。

葡聚糖是來(lái)源于腸系膜白串珠菌B-512F的分支多糖，本質(zhì)上是一種α-(1-6)鏈接的線性葡萄糖鏈。分支比例大約是5%。熒光素是通過(guò)穩(wěn)定的硫代氨甲酰鍵鏈接的，標(biāo)記過(guò)程不會(huì)引起葡聚糖的解聚。FITC標(biāo)記葡聚糖，每個(gè)葡萄糖單元對(duì)應(yīng)0.002到0.008 mol的FITC。 這些低取代度使葡聚糖電荷極小，這也是滲透性研究基本的要求。

圖1 FITC標(biāo)記葡聚糖分子結(jié)構(gòu)示意圖

FITC標(biāo)記葡聚糖的熒光適合激發(fā)波長(zhǎng)為493nm，適合檢測(cè)波長(zhǎng)為518nm（圖2）。由于熒光素的電荷依賴于溶媒的pH和離子強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度也隨著這些參數(shù)而變化。在pH>8時(shí)觀測(cè)到強(qiáng)度峰值。在生物媒介中測(cè)量，會(huì)影響熒光強(qiáng)度，增強(qiáng)或衰減。

圖2 FITC標(biāo)記葡聚糖70在pH9.0磷酸鹽緩沖生理鹽水中的熒光圖譜

圖3 FITC標(biāo)記葡聚糖在pH4-9的熒光（發(fā)射波長(zhǎng)520nm）

FITC標(biāo)記葡聚糖在密封容器室溫下可以保存6年以上。

已經(jīng)在多種介質(zhì)和不同溫度條件下調(diào)研過(guò)FITC標(biāo)記葡聚糖的穩(wěn)定性。研究表明，F(xiàn)ITC標(biāo)記葡聚糖無(wú)論在體內(nèi)或體外都很穩(wěn)定。僅當(dāng)pH>9和溫升時(shí)，存在熒光標(biāo)記水解的風(fēng)險(xiǎn)。37℃下對(duì)兔血漿、肌肉勻漿、肝勻漿和尿液的研究證實(shí)，F(xiàn)ITC標(biāo)記葡聚糖至少可穩(wěn)定3天。分子量沒(méi)有變化，熒光素亦未見(jiàn)釋放。FITC標(biāo)記葡聚糖在6%三氯乙酸溶液中在室溫下可穩(wěn)定3天。pH10-10.75時(shí)氫氧根離子對(duì)水解反應(yīng)存在特異性催化作用(1)。

通過(guò)HPLC檢測(cè)，硫代氨甲酰鍵的水解引起4-或5-氨基熒光素的增加。 一項(xiàng)未發(fā)表的研究考察了跨度5個(gè)月的時(shí)間里在壓力容器中，溫度范圍8到50°C下的 FITC標(biāo)記葡聚糖 70溶液。僅在50°C下觀測(cè)到游離氨基熒光素略微增加了1%。 僅高壓只釋放了2.7%的游離氨基熒光素。另一項(xiàng)未發(fā)表的研究表明，F(xiàn)ITC標(biāo)記葡聚糖溶液在pH 4溫度高至35°C下一個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定。即使80°C和pH 4時(shí), 硫代氨甲酰鍵可穩(wěn)定30分鐘。不過(guò)，葡聚糖可能會(huì)降解。pH 9時(shí)，1個(gè)月時(shí)間內(nèi), 相當(dāng)客觀的熒光標(biāo)記多糖(24 %)減少了。多項(xiàng)研究表明在實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間內(nèi)FITC標(biāo)記葡聚糖在體內(nèi)的穩(wěn)定性(2)。

小鼠實(shí)驗(yàn)表明, FITC標(biāo)記葡聚糖靜脈或腹腔注射量高達(dá) 6g/kg體重時(shí)，耐受性仍良好。 毒性模式與母體葡聚糖的一致。葡聚糖作為血漿擴(kuò)容劑在臨床上已經(jīng)用了50多年。人體在注射了臨床用的葡聚糖溶液后，觀察到葡聚糖誘導(dǎo)的類過(guò)敏反應(yīng) (DIARs)的發(fā)生(3,4)。 FITC標(biāo)記葡聚糖亦可能顯示類似的行為模式，但相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)問(wèn)題極少見(jiàn)諸報(bào)道。

來(lái)源于天然的葡聚糖B512F經(jīng)熒光素標(biāo)記制備了對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記葡聚糖。熒光素是通過(guò)穩(wěn)定的硫代氨甲酰鍵鏈接的，標(biāo)記過(guò)程不會(huì)引起葡聚糖的解聚。FITC標(biāo)記葡聚糖，每個(gè)葡萄糖單元對(duì)應(yīng)0.002到0.008 mol的FITC。 這些低取代度使葡聚糖電荷極小，這也是滲透性研究基本的要求。分子量超過(guò)5000 Daltons的葡聚糖分子在溶液中呈有彈性的延長(zhǎng)的卷狀。下表1顯示了不同分子量的分子空間尺寸。

Dextran MW	斯托克斯半徑 (Å)	回轉(zhuǎn)半徑 (Å)
2 x 106	270	380
1 x 106	199	275
500 000	147	200
200 000	130	130
100 000	69	95
70 000	58	80
40 000	44.5	62
10 000	23.6	-

葡聚糖和FITC標(biāo)記葡聚具有牛頓流體特征，例如粘度與剪切速率無(wú)關(guān)（圖4）。在pH4-10范圍的研究顯示，粘度與pH無(wú)關(guān)。 在pH8-9和6.5-9.5下，經(jīng)電泳，F(xiàn)ITC標(biāo)記葡聚糖的等電點(diǎn)未發(fā)生遷移(1)。

Fig. 4. 不同濃度下葡聚糖的粘度

產(chǎn)品編號(hào)	品名	分子量(kDa)	包裝
FD4-100mg	FITC標(biāo)記葡聚糖4	4	100 mg
FD4-1g			1 g
FD4-5g			5 g
FD10-100mg	FITC標(biāo)記葡聚糖10	10	100 mg
FD10-1g			1 g
FD10-5g			5 g
FD20-100mg	FITC標(biāo)記葡聚糖20	20	100 mg
FD20-1g			1 g
FD20-5g			5 g
FD40-100mg	FITC標(biāo)記葡聚糖40	40	100 mg
FD40-1g			1 g
FD40-5g			5 g
FD70-100mg	FITC標(biāo)記葡聚糖70	70	100 mg
FD70-1g			1 g
FD70-5g			5 g
FD110-100mg	FITC標(biāo)記葡聚糖110	110	100 mg
FD110-1g			1 g
FD110-5g			5 g
FD150-100mg	FITC標(biāo)記葡聚糖150	150	100 mg
FD150-1g			1 g
FD150-5g			5 g
FD500-100mg	FITC標(biāo)記葡聚糖500	500	100 mg
FD500-1g			1 g
FD500-5g			5 g
FD2000-100mg	FITC標(biāo)記葡聚糖2000	2000	100 mg
FD2000-1g			1 g
FD2000-5g			5 g

FITC標(biāo)記葡聚糖主要用于滲透性和微循環(huán)研究。也可用作分子量標(biāo)志，用于給藥研究及其它

FITC標(biāo)記葡聚糖主要用于細(xì)胞和組織中滲透性和傳遞研究。測(cè)定熒光可提供健康組織和病態(tài)組織滲透性的定量數(shù)據(jù)。可以通過(guò)活體熒光顯微鏡實(shí)時(shí)進(jìn)行。該技術(shù)靈敏度極高，組織液體中濃度低至1μg/ml亦可檢測(cè)出。 FITC標(biāo)記葡聚糖在細(xì)胞中亦可作為一種pH探針使用(6,7)。 極化實(shí)驗(yàn)也表明，熒光素結(jié)合葡聚糖仍保留了較高的旋轉(zhuǎn)自由度，激發(fā)態(tài)下的熒光壽命和未結(jié)合的相近(6)。

1. 常規(guī)過(guò)程

在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，倉(cāng)鼠頰囊的微血管是研究血漿滲漏的有效模型，例如缺血/再灌注后，或局部應(yīng)用一系列炎癥介質(zhì)、寄生蟲(chóng)和細(xì)菌。利用該技術(shù)，可以實(shí)時(shí)研究血管滲透性變化，并與白細(xì)胞粘附、活化等微血管事件相關(guān)聯(lián)。使用合適的濾光片（490/520nm）對(duì)頰囊進(jìn)行活體熒光顯微鏡檢查，并用數(shù)碼相機(jī)拍攝圖像。注射5%FITC標(biāo)記葡聚糖150生理鹽水溶液，（約100毫克/千克體重）(8-10)。

通過(guò)熒光結(jié)合立體顯微鏡對(duì)滲透性的研究，Thorball（2）報(bào)道了熒光光學(xué)顯微鏡。本文還包括FITC標(biāo)記葡聚糖參與的組織固定技術(shù)和顯微鏡設(shè)置（濾鏡、照明）的細(xì)節(jié)。用再生鈦耳室（兔子）進(jìn)行FITC標(biāo)記葡聚糖參與的血液/淋巴微循環(huán)系統(tǒng)研究。植入后4-8周可見(jiàn)淋巴生長(zhǎng)（11）。

圖5. 注射FITC標(biāo)記葡聚糖 150后拍攝的頰囊圖像。第二張圖顯示的是服用組胺后微血管的滲漏
(圖片版權(quán)E. Svensjö)

2.腸道組織的滲透性研究

使用FITC標(biāo)記葡聚糖 150 (12)研究處于炎癥期的腸上層單皮的滲透性。使用FITC標(biāo)記葡聚糖4（13）研究蛋白酶抑制劑對(duì)胃腸道粘膜糜爛和上皮功能障礙的作用。Thorball做了大量使用FITC標(biāo)記葡聚糖在胃腸道進(jìn)行組織固定的研究(2)。FITC標(biāo)記葡聚糖 (4000-70000)用于皮膚熱損傷在體外使用改進(jìn)型尤斯灌流室后引起的滲透性變化(14)。請(qǐng)參看參考資料(15,16)。

3. 大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的滲透性研究

有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)中FITC標(biāo)記葡聚糖的研究，需要示蹤劑固定技術(shù)，使神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、坐骨神經(jīng)內(nèi)脊膜、神經(jīng)節(jié)等特征具有良好的光學(xué)分辨率。采用干燥解剖組織樣品冷凍、80℃甲醛蒸汽固定，石蠟或塑料包埋的方法證明效果良好（17）。在安裝和檢測(cè)之前，這些切片要浸入二甲苯中。

給倉(cāng)鼠和小鼠靜脈注射了FITC標(biāo)記葡聚糖（Mw 3000到150000），研究在體內(nèi)的分布。正常的大腦皮層神經(jīng)周圍擴(kuò)散屏障，均不被上述分子量范圍內(nèi)FITC標(biāo)記葡聚糖滲透（19）。倉(cāng)鼠的注射量為0.5ml生理鹽水，含濃度為5mg /10g體重的FITC記葡聚糖（18）。調(diào)查了FITC標(biāo)記葡聚糖對(duì)海馬體滲透性的影響。聚焦超聲用于血腦屏障檢查，分析FITC標(biāo)譜聚糖的滲透情況（19）。

采用靜脈注射FITC標(biāo)記葡聚糖150（20）檢測(cè)缺血再灌注損傷后，與時(shí)間相關(guān)的腦血管滲透性。通過(guò)FITC標(biāo)記葡聚糖監(jiān)測(cè)蛋白相關(guān)滲透性變化，進(jìn)行急性肝功能衰竭后腦水腫的研究（21）。

4. 腫瘤組織的滲透性研究

Gerlowski（22）介紹了透射光熒光電視顯微鏡用于腫瘤組織中微血管滲透性的實(shí)時(shí)研究。在兔耳腔模型中使用了FITC記葡聚糖150。作者每隔90分鐘檢測(cè)濃度從0.6 mg到30 mg/100 ml的FITC標(biāo)記葡聚糖的猝滅作用。只有接近濃度峰值時(shí)才會(huì)猝滅。T. Li和同事（23）使用FITC標(biāo)記葡聚糖500研究聚焦超聲對(duì)肉瘤細(xì)胞膜滲透性的影響。FITC標(biāo)記葡聚糖還應(yīng)用于卵巢癌細(xì)胞的內(nèi)吞作用研究（24）。

5. 眼窩內(nèi)的滲透性研究

E. Mannerma和同事（25）使用FITC標(biāo)記葡聚糖40等探針研究藥物在視網(wǎng)膜色素上皮中的滲透過(guò)程。FITC標(biāo)記葡聚糖用于評(píng)估TNFF-alpha引起的屏障功能障礙（26）。S. Lightman和同事（27）詳細(xì)研究了炎癥模型視網(wǎng)膜血管的滲漏。反復(fù)多劑量的FITC標(biāo)記葡聚糖，耐受性良好。研究了FITC標(biāo)記葡聚糖和熒光素離開(kāi)玻璃體的途徑（28）。C.B.Toris和同事（29）使用FITC標(biāo)記葡聚糖檢查了常規(guī)眼疾的葡萄膜鞏膜外流。描述了血-視網(wǎng)膜外屏障的體外模型（30）。

6.腎組織滲透性研究

70%劑量的FITC標(biāo)記葡聚糖4在第一個(gè)小時(shí)內(nèi)快速分泌至尿液(兔子、老鼠)(未發(fā)表數(shù)據(jù))。Lencer和同事(31)研究報(bào)道了FITC標(biāo)記葡聚糖10作為探針探測(cè)腎臟內(nèi)腎小球的功能和定位。對(duì)切除組織的冷凍切片進(jìn)行了熒光顯微鏡檢查。

多種應(yīng)用

FITC標(biāo)記葡聚糖曾用于體外鼻粘膜的滲透性研究 (32)。該項(xiàng)研究還涉及帶電荷的 FITC標(biāo)記葡聚糖衍生物。 使用載有溶解微針的FITC標(biāo)記葡聚糖20用于藥物在皮膚的直接擴(kuò)散研究(33)。

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