脂質過氧化研究的新工具 - LipiRADICAL Green（檢測試劑）/OH-Pen（抑制物質）

來源：作者：人氣：-發表時間：2023-10-09 09:15:00【大中小】

LipiRADICAL Green（檢測試劑）/OH-Pen（抑制物質）

脂質過氧化研究的新工具！脂質自由基檢測試劑和抑制物質

LipiRADICAL Green是特異性熒光檢測脂質過氧化反應的上游因子脂質自由基的試劑?？捎糜诨罴毎上瘛悠分兄|自由基含量的相對定量以及樣品中脂質自由基的結構分析和鑒定。另外，OH-Pen還可作為脂質自由基特異性中和劑使用。

※ 本產品基于九州大學大學院藥學研究院生命物理化學領域山田健一教授的研究結果商品化并銷售。

※ 本產品僅供研究用，研究以外不可使用。

本試劑的概要圖和活細胞成像示例

脂質自由基發生特異性反應產生綠色熒光的LipiRADICAL Green原理示意圖（左），以及用藥物刺激Hepa1-6細胞時的活細胞成像示例（右）。

◆什么是脂質過氧化反應（LPO）和脂質自由基（Lipid radical）？

脂質過氧化反應（lipid peroxidation; LPO）是指由于氧化應激脂質被氧化分解的反應，是脂質分解的過程之一。以含有多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid; PUFA）的脂質為起點，目前已提出兩種脂質過氧化反應的發生過程：

1.氧化應激引起的脂質自由基產生

2. Lipoxygenase引起的過氧化脂質生成和鐵離子依賴性過氧化脂質自由基的產生

第1種發生過程是由含PUFA的脂質暴露于氧化應激（活性氧ROS）時產生脂質自由基（L.；Lipid radical）開始。脂質自由基容易被氧化并轉化為過氧化脂質自由基（LOO?; Lipid peroxyl radical），誘導自由基連鎖反應。在第2種發生過程中，含PUFA的脂質被過氧化催化酶lipoxygenase轉化為過氧化脂質（LOOH），并在存在大量的鐵離子Fe²⁺ 時會誘導產生過氧化脂質自由基（LOO?）。過氧化脂質自由基與其他脂質反應，誘導自由基連鎖反應。

兩種過程所產生的過氧化脂質自由基（LOO?）都會在與其他脂質發生自由基反應并擴大自由基連鎖反應，同時產生各種過氧化脂質（LOOH）。該自由基連鎖反應直至被抗氧化劑聚合前會持續進行，并生成各種脂質結構或醛，最終產生復數的反應活性醛，如acrolein、malondialdehyde（MDA）、4-hydroxy-2-nonenal （4-HNE）等。以這些下游活性物質為起因，會對ER應激、細胞毒性和誘導鐵死亡等產生各種影響。

脂質自由基（以及過氧化脂質自由基）被認為是脂質過氧化反應中最重要的最上游因子，雖然其檢測方法備受期待，但直到現在，也僅有電子自旋共振（ESR）法等需要特殊設備的方法。LipiRADICAL Green和OH-Pen是由九州大學大學院藥學院研究院生命物理化學系的山田健一教授等人開發的、具有新型氮氧化物骨架的脂質自由基響應性熒光試劑（原名稱為NBD-Pen）和抑制劑，它們不與活性氧自由基反應，實現特異性響應脂質自由基。由于LipiRADICAL Green可通過熒光檢測來觀察/分析脂質自由基，因此可用作以脂質自由基為中心的脂質過氧化反應的新工具。OH-Pen是從LipiRADICAL中去除熒光基團NBD的化合物，與一般的自由基中和劑（TEMPO等）不同，對脂質自由基顯示高選擇性，可作為脂質過氧化反應的特異性抑制劑使用。

◆原理

LipiRADICAL Green是向穩定自由基化合物的氮氧化物衍生物中添加熒光色素NBD的化合物。由于氮氧化物對脂質自由基顯示高特異性，所以導入了戊基。LipiRADICAL Green此時處于消光狀態，但通過脂質自由基與自由基-自由基偶聯形成共價鍵后，顯示綠色熒光。通過觀察該綠色熒光強度，可相對定量樣品中脂質自由基含量。

OH-Pen是LipiRADICAL Green的NBD轉化為羥基的化合物，顯示相同的脂質自由基選擇性以及擁有相同的脂質自由基中和作用。因此可將其用作脂質過氧化反應的抑制劑。

概述：對使用LipiRADICAL Green的脂質自由基進行分析

通過使用LipiRADICAL Green的熒光檢測LC/MS-MS法可分析脂質自由基和過氧化脂質自由基。原著論文5中，已成功地從5種類型的PUFA中鑒定出共計132種脂質自由基。以下為流程概述，詳細的實驗方案、LC/MS-MS設置方法/分析方法，請參閱原著論文5。

■概述

步驟1	添加本試劑至含脂質的自由基樣品中，并熒光標記脂質自由基。 ※ 若是動物實驗，將本試劑施藥于小鼠等動物并在動物體內熒光標記脂質自由基后，馬上摘除器官并提取脂質組分。
步驟2	通過熒光檢測LC/MS進行綠色熒光標記產物的質量分析。
步驟3	減去所得質量值中LipiRADICAL Green的分子量（理論值389.2068），并推斷結構。

◆特點

LipiRADICAL Green

●　本試劑為消光狀態，與脂質自由基/過氧化脂質自由基特異性反應，發出綠色熒光。

●　檢測波長標準：激發470 nm /熒光520-600 nm（最大~540 nm）。

※ 詳情請參閱數據。

●　對脂質自由基和過氧化脂質自由基具有特異性，在活性氧（H₂O₂、ClO^-?、O₂^-?、?OH）中不發出熒光。

●　可通過熒光強度相對定量體外樣品中的脂質自由基含量。

●　施藥于動物個體后，可在組織水平上進行染色以及相對定量活體內的自由基含量。

※ 由于脂質自由基非常不穩定且會迅速分解，需要對實驗方法和條件設置進行驗證。詳情請參閱原著論文1。

●　可用于評價任意化合物的脂質自由基誘導活性和抗氧化活性。

※ 詳情請參閱原著論文4。

●　通過用熒光檢測LC/MS可全結構分析脂質自由基和過氧化脂質自由基。

※ 脂質自由基和過氧化脂質自由基的結構分析方法，請參考原著論文5。

OH-Pen

●　與脂質自由基和過氧化脂質自由基發生特異性反應以抑制自由基連鎖反應，可用作脂質過氧化反應信號上游的抑制劑。

●　雖然是自由基化合物，但非常穩定，可體外施藥至動物個體。

●　肝細胞癌的動物實驗模型（diethylnitrosamine（DEN）給藥模型）中顯示，可抑制DEN誘發的脂質過氧化反應信號和組織損傷標志物。

注意：LipiRADICAL Green和OH-Pen的區別在于有無熒光基團（請參閱“原理”），對脂質自由基的反應性相同，同時使用時，可能會引起對

注意：脂質自由基的競爭性反應，因此需注意使用方法。

◆原著論文

1)　Yamada Nat. Chem.Biol.,12,608～613(2016)Fluorescence probes to detect lipid-derived radicals.

2)　Enoki et al., Chem.Commun.,53,10922～10925(2017)Lipid radicals cause light-induced retinal degeneration.

3)　Ishida et al., Free Radical Biol.Med.,113,1487～493(2017)Detection and inhibition of lipid-derived radicals in low-density lipoprotein.

4)　Mishima et al., J.Am. Soc.Nephrol.,31,280～296 (2020)Drug Repurposed as antiferroptosis agents suppress organ damage, including AKI, by functioning as lipid peroxyl radical scavengers.

5)　Matsuoka et al.,Anal. Chem.,92,6993～7002(2020)Method for Structural Determination of Lipid-Derived Radicals.

◆參考數據

脂質自由基特異性熒光光譜

添加花生四烯酸（AA）和Lipoxygenase（LOX）至LipiRADICAL Green，觀察470 nm的激發熒光。在未添加LOX的條件下，幾乎沒有觀察到熒光，而添加LOX并產生脂質自由基后，可觀察到500-650 nm范圍內的熒光（最大540 nm附近）（左）。由此看出，熒光強度取決于添加的LOX濃度（右）。

自由基特異性

觀察在以下條件中添加各試劑至LipiRADICAL Green的熒光強度（激發470 nm/熒光530 nm）?？捎^察到活性氧中的熒光幾乎沒有變化，而通過LOX酶或氧化誘導物質（AAPH和MeO-AMVN）的3種脂質產生的脂質自由基產生時的熒光強度有所上升。

H₂O₂, ClO^- , KO₂（O₂^-?）,?OH ：0.5 mM Lipids 0.5 mM (LA: linoleic acid, ALA: α-linoleic acid, AA: arachidonic acid ) + LOX 2.5 μg/mL or AAPH 10 mM or MeO-AMVN 50 μM

◆應用數據

活細胞成像

添加LipiRADICAL Green（1 μM）至Hepa1-6細胞培養20 min后，追加致癌性亞硝胺化合物DEN（30 mM）培養20 min，然后每隔2 min用激光共聚焦熒光顯微鏡進行活細胞成像（激發458 nm/熒光490-674 nm）。經DEN處理的細胞在添加試劑后，熒光強度立即隨培養時長的增加而增加，這表明DEN是按順序產生脂質自由基的。熒光顯微鏡圖像為添加試劑后20 min內的數據。

體外檢測LDL來源的脂質自由基

用氧化誘導物質Hemin或AAPH處理純化的低密度脂蛋白LDL（20 μg protein/mL），添加LipiRADICAL Green（10 μM）并觀察1 h內的熒光強度（激發470 nm/熒光530 nm），可檢測到Hemin、AAPH隨時間推移和試劑濃度依賴性熒光強度的增加，出現了不同的增加趨勢。

脂質自由基結構分析

1）評價由氧化誘導劑（AAPH + Hemin）產生的自由基

體外添加LOX（10 μg/mL）和氧化誘導物質AAPH+Hemin（10 μM）至花生四烯酸（AA）中，誘導脂質自由基后添加LipiRADICAL Green并進行檢測反應。之后通過Bligh＆Dyer法純化脂質成分，并用熒光LC/MS-MS對AA產生的自由基進行分析。

上圖：熒光LC色譜（激發470 nm/熒光530 nm）。檢測出多個峰，對各個峰進行MS-MS分析。

下圖：用MS-MS分析比較經鑒定的各種脂質自由基生成量（注：用各自由基種類的LC峰面積的相對定量）。鑒定出8種類型的AA過氧化脂質自由基（圓圖中的紅線），此外還鑒定了由AA裂解產生的29種脂質自由基（條形圖、綠線）。

* 有關詳細的實驗方案和分析方法，請參閱原著論文5。

2）DEN誘導時內源性產生的脂質自由基檢測

向小鼠施以致癌性亞硝胺化合物DEN，分別在1 h、4 h、24 h后進行麻醉，向腹腔內施以LipiRADICAL Green，之后切除肝臟并壓碎，用Bligh＆Dyer法制備脂質提取液。并用熒光LC/ MS對各提取物進行各脂質自由基的鑒定以及相對定量。另外，NBD-Pen給藥前15 min先施以脂質自由基抑制劑OH-Pen?？捎^察到左圖所示的熒光LC色譜圖，用MS/MS分析鑒定出共計11種類型的脂質自由基。隨時間觀察各脂質自由基種類（右圖為C₅H₁₁的檢測結果），可觀察到DEN給藥4 h后質譜峰面積大幅增加，而24 h后減少。LipiRADICAL Green給藥前，經OH-Pen處理的小鼠脂質自由基被明顯抑制。

* 有關詳細的實驗方案和分析方法，請參閱原著論文5。