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特異性細胞核實時成像試劑 NucleoSeeing?＜Live Nucleus Green＞

來源：作者：人氣：-發表時間：2023-08-28 12:45:00【大中小】

特異性細胞核實時成像試劑

NucleoSeeing ＜Live Nucleus Green＞

NucleoSeeing是與DNA特異性結合并發出綠色熒光的實時成像用細胞核染色試劑。不僅是動物細胞和組織，擬南芥的葉細胞中也顯示出高S/N比，并可很好的觀察活細胞中細胞核動態。另外，還可用作細胞核pH sensor。

※本產品基于名古屋工業大學的研究成果商品化而成。

※本產品僅供科研使用。嚴禁用于科研以外用途。

使用了NucleoSeeing的各種樣本的染色案例

將HeLa細胞（左），擬南芥表皮細胞和保衛細胞（中），小鼠腦海馬切片培養（右）活細胞成像后進行觀察。詳情請參考各個案例的數據。

◆活細胞的細胞核成像

MEMO

細胞核作為DNA的儲存庫負責細胞分裂和控制基因表達，是細胞中最重要的細胞器之一。因此細胞核動力學的動態實時成像就成為了非常重要的課題。從以前開始就開發了各種核染色試劑，雖然核酸應答性的藍色熒光色素Hoechst系列和DAPI被廣泛運用，但由于這些藍色熒光素使用紫外線作為激發光，光毒性強，存在不適用于活細胞成像的問題。最近，雖然開發了一些適用于活細胞的核染料，如綠色和紅色熒光色素，但是化合物的細胞毒性和核染色的特異性仍然存在問題。

NucleoSeeing是名古屋工業大學的筑地真也教授等人開發的DNA特異性綠色熒光化合物，可以在細胞培養，組織培養以及擬南芥葉等的植物細胞中進行活細胞成像。本產品細胞毒性低，DNA特異性顯示高S/N比，以及優異的細胞核染色性能。也可用于觀察固定細胞，應用靈活。另外，由于其擁有特殊的pH依存性熒光特性，還可以用作細胞核特異性的pH sensor。近年，在細胞核內pH重要性的研究中，還可以期待本產品作為核內pH檢測的專用試劑。

各種細胞核染料的比較參數

染色試劑名稱	光特性			化合物的物性			觀察方法
染色試劑名稱	檢測波長激發/熒光（nm）	熒光色	光毒性	核特異性	細胞膜滲透性	細胞毒性	活細胞	固定細胞
NucleoSeeing	488 / 520	綠	無	√	√	無	√	√
Hoechst	350 / 461	藍	有	√	√	有	√	√
DAPI	350 / 461	藍	有	√	×	不明	×	√
X公司產品	485 / 498	綠	√	△	√	不明	√	√
Y公司產品	646 / 680	紅	√	√	√	有	√	√

◆原理

NucleoSeeing是細胞膜滲透性的綠色核染色試劑，由綠色熒光色素和DNA特異性結合tag組成。本產品在DNA不存在時顯示折疊構造，雖然有消光狀態，但與DNA結合時構造發生改變，發出綠色熒光。由于NucleoSeeing攝入細胞內后與DNA結合時發出綠色熒光，因此可以特異性觀察細胞核。

◆特點

●　僅在與DNA結合時發出綠色熒光，顯示高S/N比。由于在培養基中會消光，因此在添加了培養基的狀態下也可以高靈敏度地進行觀察

●　※想要提高靈敏度，則建議染色后更換培養基后再進行觀察。

●　激發光/發射光波長：488 nm/520 nm

●　和傳統的Hoechst等試劑相比，幾乎沒有發現細胞毒性。

●　不僅僅是活細胞成像，還可以染色固定細胞，活細胞成像后再固定細胞進行觀察，也可以用于免疫染色實驗。

●　無論是動物來源的細胞和組織培養，還是植物細胞（擬南芥葉細胞），都可以進行高S/N比的核染色。

●　觀察植物細胞時，不受葉綠體來源的自身熒光（Em：>615 nm）的影響，可以僅將細胞核可視化。

●　能夠可逆性染色。培養基更換12~24小時后，染料幾乎全部被排出細胞外。

●　由于可以看見pH依賴性的熒光強度的變化，所以在pH 6~8之間，可以通過2個波長的熒光強度比（Ex 405 nm, Em 520 nm / 460 nm），作為細胞核內的pH sensor使用。

◆應用

●　動物來源培養細胞的活細胞成像

●　植物細胞的活細胞成像

●　免疫染色中的細胞核染色

●　細胞核內pH sensor（pH 6~8）

◆原著論文

※ 本產品NucleoSeeing是以下論文中的hoeAc₂FL。

1.	Nakamura, A., et al., Chem. Commun., 50, 6149～6152 (2014) "Hoechst tagging: a modular strategy to design synthetic fluorescent probes for live-cell nucleus imaging."
2.	Ueda, M., et al., ACS Cent. Sci., 3 (5), 462～472 (2017) "Noncanonical function of a small-molecular virulence factor coronatine against plant immunity: an in vivo raman imaging approach."
3.	Nakamura, A. and Tsukiji, S., Bioorg. Med. Chem. Lett., 27 (14), 3127～3130 (2017)"Ratiometric fluorescence imaging of nuclear pH in living cells using hoechst-tagged fluorescein."

◆應用實例

DNA應答性的熒光特性和細胞核特異性染色

左：NucleoSeeing僅在DNA存在時顯示出強的綠色熒光。激發光488 nm。

右：在活細胞中，與DNA特異性結合的Hoechst33342（藍）和NucleoSeeing（綠）進行共染色的結果，顯示出高度的一致性。

細胞毒性

作為藍色核染色試劑被廣泛使用的Hoechst33342和NucleoSeeing，利用MTT法確認其細胞毒性。Hoechst在5 μM時觀察到了顯著的細胞死亡，而NucleoSeeing在5 μM時還未觀察到細胞毒性。

可逆性染色

為了評價Hoechst33342和NucleoSeeing的細胞滯留性，分別用1 μM兩種試劑處理15分鐘后，更換培養基，去除剩余的試劑，觀察24小時熒光強度的變化。Hoechst33342在24小時后依然維持80%的熒光強度，顯示出不可逆性，與之相對NucleoSeeing隨著時間推移，熒光強度逐漸減弱，12小時以后幾乎全部排出。因此，NucleoSeeing可以作為可逆性的核染色試劑使用。

各種培養細胞的核染色

添加1 μM的 NucleoSeeing 至各種培養細胞的培養基中，染色15分鐘后，更換培養基觀察活細胞，無論哪種細胞都觀察到了核特異性的信號。

小鼠腦（海馬）切片培養組織的染色案例

添加20 μM 的NucleoSeeing至小鼠腦海馬切片培養組織的培養基中，染色15分鐘后，更換培養基在未固定的條件下進行觀察。

固定細胞的染色案例

左：用4%多聚甲醛固定處理HeLa細胞后，用PBS清洗細胞，添加1 μM的 NucleoSeeing染色15分鐘。染色后，清洗并觀察。

右：添加5 μM 的NucleoSeeing染色15分鐘，用4%多聚甲醛固定細胞并進行觀察。

※雖然也可用甲醇進行固定，但信號可能會減弱。

擬南芥葉的保衛細胞染色案例

用20 μM 的NucleoSeeing處理擬南芥葉的切片60分鐘后，清洗切片進行觀察。激發光為488 nm時，在綠色熒光范圍490~555 nm內觀察保衛細胞的細胞核，615 nm以上波長范圍中觀察到葉綠體來源的自身熒光。通過使用本試劑，可以在觀察時區分葉綠體的自身熒光和細胞核熒光，期待本品可作為植物細胞的核動態成像試劑使用。

※擬南芥葉的保衛細胞的核染色是由名古屋工業大學的筑地教授等人和東北大學上田實教授等人共同研究發現的成果。

Ueda, M., et al., ACS Cent. Sci., 3 (5), 462～472 (2017)"Noncanonical function of a small-molecular virulence factor coronatine against plant immunity: an in vivo raman imaging approach."

擬南芥葉表皮細胞的染色案例

用20 μM的 NucleoSeeing處理擬南芥葉的切片60分鐘后，清洗切片進行觀察。確認表皮細胞的核特異性染色。

◆使用NucleoSeeing作為核內pH sensor

細胞核有著由外膜和內膜這兩層脂質雙分子層膜構成的核膜這種獨特結構，與細胞質分隔開來。細胞核內和細胞質之間的物質交流需要通過細胞核孔進行，但學者們認為細胞核內的環境和細胞質的環境是不同的。近年，有學者提出核膜中存在核膜特異性質子泵（H⁺-ATPase），在細胞核和細胞質之間產生質子梯度。雖然可以期待通過生理現象變化來檢測細胞核內的pH值，但是至今還沒有開發出十分理想的試劑。

名古屋工業大學筑地教授等人證明NucleoSeeing具有pH依賴性熒光特性，可以作為細胞核傳感器使用。NucleoSeeing作為細胞核染色試劑，一般在激發光480 nm/熒光520nm的范圍使用，但是在激發光405 nm時使用的話，在460 nm以及520 nm左右的熒光會依賴pH值發生變化。通過檢測激發光405 nm時460 nm和520 nm的熒光強度比（F520 / F460），觀察pH5.5～8.5之間的S形曲線。利用這個原理，就可以評估細胞核內的pH值。

■　原著論文

Nakamura, A. and Tsukiji, S., Bioorg. Med. Chem. Lett., 27 (14), 3127～3130 (2017)"Ratiometric fluorescence imaging of nuclear pH in living cells using hoechst-tagged fluorescein."

◆NucleoSeeing用作細胞核內pH sensor的原理和特點

（參考數據）in vitro中NucleoSeeing的pH依賴性熒光特性

左：在NucleoSeeing的激發波長405 nm時熒光光譜和pH依賴性。在pH5.5~8.5之間，460 nm和520 nm附近的熒光強度隨著pH值降低而增強。

右：在各pH值中，460 nm和520 nm的熒光強度F（激發波長405 nm）和熒光強度比(F520 / F460)。

<注>NucleoSeeing針對活細胞用的細胞膜滲透性進行了優化，攝入細胞內以后，被酯酶水解并轉化為活性本體。本數據是為了驗證使用了化學合成的活性本體（NucleoSeeing的水解產物）進行in vitro獲得的數據。請注意直接使用NucleoSeeing進行in vitro不可能重現本數據。