WakoPURE system采用世界首創(chuàng)的再構(gòu)成系無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成技術(shù),對(duì)于復(fù)制、翻譯及能量再生所需要的約30種因子進(jìn)行調(diào)制、精制后,再加以重新構(gòu)成。其中包括大 腸菌的翻譯因子--開始因子(IF1、IF2及IF3)、伸長(zhǎng)因長(zhǎng)(EF-G、EF-Tu及EF-Ts)、終結(jié)因子(RF1、RF2及RF3)、脂質(zhì)體循 環(huán)因子、與20種氨基酸相對(duì)應(yīng)的氨基酰tRNA合成酶、甲硫氨酸酰胺tRNA轉(zhuǎn)移酶、T7 RNA聚合酶等。此外,還包括脂質(zhì)體、氨基酸、tRNA、能量源及能量再生系統(tǒng)。

 對(duì)于上述構(gòu)成因子(脂質(zhì)體蛋白質(zhì)除外),均添加了組氨酸標(biāo)簽。通過使用金屬新和樹脂,使反應(yīng)所需的因子與目標(biāo)蛋白質(zhì)之外的構(gòu)成因子相結(jié)合,再通過限外過濾即可除去樹脂結(jié)合因子與脂質(zhì)體蛋白質(zhì)。采用這種方法,可以在短時(shí)間內(nèi)得到高純度、無標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白質(zhì)。

【特點(diǎn)】

● 通過逆反應(yīng)用標(biāo)簽系統(tǒng),使蛋白質(zhì)的精制變得更容易。
● 使天然序列蛋白質(zhì)的精制更容易。
● 由于是重組系,因此不含有雜質(zhì)蛋白質(zhì)。
● 從合成到精制結(jié)束只需要三個(gè)小時(shí)。
● RNase污染極少。

【擴(kuò)大反應(yīng)規(guī)模】

采用WakoPURE system,可以根據(jù)需要擴(kuò)大反應(yīng)規(guī)模。單個(gè)產(chǎn)品為50μl。如使用多個(gè)產(chǎn)品,則可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的大量合成。增加反應(yīng)液并不會(huì)影響合成效率。

使用試劑盒中的二氫葉酸還原酶(DHFR)對(duì)照劑,在37°C條件下進(jìn)行DHFR合成反應(yīng)一小時(shí)后,對(duì)每一道使用5μl。然后進(jìn)行SDS-PAGE,最后用SYPRO RED進(jìn)行染色。

【Q&A】

Q: 所用的模板需要什么條件?

A: WakoPURE system可用于PCR產(chǎn)物或者質(zhì)粒。但是,模板需要具備下列序列(亦可以是RNA)。

·開始密碼子:(ATG)

·終止密碼子:(TAG、TGA或TAA三者之一)

·在基因上流應(yīng)有T7操縱子序列

·在開始密碼子的上流約10個(gè)堿基處應(yīng)有脂質(zhì)體結(jié)合部位(SD序列)

·在終止密碼子的下流應(yīng)有6個(gè)堿基以上的序列(適用于PCR產(chǎn)物)

·在終止密碼子的下流應(yīng)有復(fù)制終止子序列(適用于質(zhì)粒DNA)

Q: 蛋白質(zhì)合成量有多少?
A: 最大獲取量為100μg/ml。平均合成量為20~50μg。

編號(hào)	品名	容量
299-59501	WakoPURE System （體外蛋白質(zhì)合成試劑盒）	4次用
295-59503		16次用

 <四次用試劑盒>

A溶液 .................................. 25μl×4支

B溶液 .................................. 10μl×4支

DHFR對(duì)照劑 ............................ 5μl×1支

通用啟發(fā)劑 .............................. 80μl×1支

 

<十六次用試劑盒>

A溶液 .................................. 25μl×16支

B溶液 .................................. 10μl×16支

DHFR對(duì)照劑 ..........................5μl×1支

通用啟發(fā)劑 .............................80μl×1支

 在 蛋白質(zhì)組分析中,經(jīng)常會(huì)使用質(zhì)譜儀來進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定及翻譯后的修飾。根據(jù)電離方法及分析儀的不同組合,質(zhì)譜儀可以分為多種類型。在測(cè)定肽的質(zhì)譜時(shí),通常 會(huì)采用MALDI法(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization,即基質(zhì)輔助激光解附電離法)及ESI法(Electrospray Ionization,即電噴霧電離質(zhì)譜法)。MALDI法的長(zhǎng)處在于可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)于多種樣品進(jìn)行處理,而在使用串聯(lián)質(zhì)譜儀獲取肽的序列信息時(shí),則可 以采用ESI法。MLADI法是將樣本添加在一種被稱為基質(zhì)(matrix)的化合物上,制成混合結(jié)晶,然后再用激光照射其表面以實(shí)現(xiàn)離子化。用作基質(zhì)的 化合物可以是α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid)、芥子酸(Sinapic Acid,SA)或者2,5-二羥基苯甲酸(2,5-Dihydroxybenzoic Acid, DHB)。根據(jù)樣本的不同,可選用不同的基質(zhì)。一般說來,CHCA適用于肽類樣品,SA適用于蛋白質(zhì)樣品,而DHB則適用于肽、糖類及糖脂類樣品。但是, 對(duì)于市面上出售的基質(zhì)產(chǎn)品,如果不進(jìn)行任何處理而加以使用,則在質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)上會(huì)出現(xiàn)來源于基質(zhì)的峰值,本底較高,信噪比較小。因此,對(duì)于這些基質(zhì),在使用前應(yīng)進(jìn)行再結(jié)晶處理,以盡可能除去源自基質(zhì)的峰質(zhì)。

編號(hào)	品名	用途	容量
037-19261	α-氰基-4-羥基肉桂酸 [CHCA]	蛋白質(zhì)組分析用	50mg×5支
192-13361	芥子酸 [SA]	蛋白質(zhì)組分析用	50mg×5支
044-29101	2,5-二羥基苯甲酸 [DHB]	蛋白質(zhì)組分析用	50mg×5支

編號(hào)	品名	用途	容量
125-05061	賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶，質(zhì)譜分析級(jí)	蛋白質(zhì)組分析用	20μg×5支
202-15951	豬胰島素，質(zhì)譜分析級(jí)	蛋白質(zhì)組分析用	20μg×5支
293-57701	陰性膠片染色劑質(zhì)譜分析套裝	電泳分析用	20次
299-58901	銀染試劑質(zhì)譜分析套裝	電泳分析用	20次