Cell：從結(jié)構(gòu)上詳細(xì)闡明單結(jié)構(gòu)域駱駝抗體可強(qiáng)效中和包括SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2在內(nèi)的β冠狀病毒

來源：作者：人氣：-發(fā)表時(shí)間：2020-04-29 13:10:00【大中小】

冠狀病毒是一種有包膜的、正義RNA病毒，分為4個(gè)屬（α、β、γ和δ），可感染多種宿主生物。至少有7種冠狀病毒可引起人類疾病，其中4種病毒（HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-229E）在全球范圍內(nèi)季節(jié)性地在人群中流行，在大多數(shù)患者中引起輕度呼吸道疾病。剩下的三種病毒，即SARS-CoV（也稱為SARS-CoV-1）、MERS-CoV和SARS-CoV-2，是人畜共患病的病原體，在人群中出現(xiàn)后，已經(jīng)引起了流行病或大流行病，癥狀嚴(yán)重且往往是致命的。對于這些高致病性的β冠狀病毒，預(yù)防性和治療性的干預(yù)是需要的。
Cell：從結(jié)構(gòu)上詳細(xì)闡明單結(jié)構(gòu)域駱駝抗體可強(qiáng)效中和包括SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2在內(nèi)的β冠狀病毒

冠狀病毒表面有刺突糖蛋白（S），它是一種大型I類融合蛋白。S蛋白形成了一個(gè)三聚體復(fù)合物，在功能上可分為兩個(gè)不同的由一個(gè)蛋白酶切割位點(diǎn)分隔開的亞基，即S1和S2。S1亞基包含受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD），它與宿主細(xì)胞受體蛋白相互作用，觸發(fā)膜融合。S2亞基包含膜融合復(fù)合物，包括疏水性融合肽和α-螺旋七肽重復(fù)區(qū)。SARS-CoV和MERS-CoV的功能性宿主細(xì)胞受體分別是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）和二肽基肽酶4（DPP4）。無論是在結(jié)構(gòu)上還是在生物物理學(xué)上，這些受體與各自的RBD之間的相互作用已經(jīng)被充分地表征了。最近，有報(bào)道稱SARS-CoV-2 S蛋白也利用ACE2作為功能性宿主細(xì)胞受體，并且已經(jīng)報(bào)道了這種復(fù)合物的幾種結(jié)構(gòu)。

最近在低溫電鏡（cryo-EM）方面的進(jìn)展使得科學(xué)家們能夠確定這種三聚體刺突蛋白胞外域（ectodomain）的高分辨率結(jié)構(gòu)，并了解S蛋白作為一種大分子機(jī)器的功能。對SARS-CoV刺突的初始低溫電鏡表征顯示它的RBD至少采用了兩種不同的構(gòu)象。在 “向上（up）”構(gòu)象中，RBD相對于S蛋白的其余部分向外突出，這樣，它們可以很容易地與ACE2結(jié)合而不發(fā)生立體沖突。在“向下（down）”構(gòu)象中，RBD緊緊貼著S2亞基的頂部，防止被ACE2結(jié)合。隨后的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一現(xiàn)象，并且在MERS-CoV S蛋白、SARS-CoV-2 S蛋白和α冠狀病毒S蛋白中也觀察到了類似的動(dòng)態(tài)。由于在向上構(gòu)象的三個(gè)RBD中，通過低溫電鏡可以觀察到的顆粒豐度相對較低，因此有人認(rèn)為這種構(gòu)象可能對應(yīng)于能量不穩(wěn)定狀態(tài)。這些觀察結(jié)果讓人們提出冠狀病毒RBD可能作為分子棘輪發(fā)揮作用的假說：受體結(jié)合事件會將RBD保持在這種不太穩(wěn)定的向下構(gòu)象中，導(dǎo)致S1逐漸失去穩(wěn)定，直到S2最終被觸發(fā)而啟動(dòng)膜融合。最近的實(shí)驗(yàn)表明靶向RBD的抗SARS-CoV抗體讓SARS-CoV RBD保持在這種向上構(gòu)象中并導(dǎo)致它的融合前刺突失去穩(wěn)定，從而為這一假說提供了支持。

人們已經(jīng)報(bào)道了許多抗SARS-CoV RBD抗體和抗MERS-CoV RBD抗體，它們的中和機(jī)理可歸因于受體結(jié)合位點(diǎn)的封閉和讓RBD保持在這種不穩(wěn)定的向上構(gòu)象中，從而作為受體模擬物有效地觸發(fā)融合前構(gòu)象過早地轉(zhuǎn)變到融合后構(gòu)象。除常規(guī)抗體外，駱駝科動(dòng)物還產(chǎn)生僅有重鏈的抗體（HCAb），其僅包含一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域（VHH）而不包含構(gòu)成常規(guī)IgG抗體的抗原結(jié)合片段（Fab）的兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域（VH和VL）。在沒有效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的情況下，單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域被稱為單結(jié)構(gòu)域抗體、VHH或納米抗體（Nanobody），通常可獲得與常規(guī)抗體相當(dāng)?shù)目乖H和力和特異性。VHH可以很容易地構(gòu)建成多價(jià)形式，并且比大多數(shù)抗體具有更高的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。此外，已知VHH對空間障礙的敏感性較小，而空間障礙可能會阻止較大的常規(guī)抗體結(jié)合。它們的優(yōu)越的生物物理特性已導(dǎo)致評估了幾種VHH抵抗呼吸道合胞病毒（RSV）等常見呼吸道病原體的療效。

在呼吸道感染中將VHH用作生物制劑是一種特別有吸引力的應(yīng)用，這是因?yàn)榭梢詫⒏叨确€(wěn)定的VHH霧化并通過吸入器直接施用于感染部位。此外，由于VHH在長時(shí)間保存后仍保持穩(wěn)定，可以將它們儲存起來作為疫情爆發(fā)時(shí)的治療選擇。盡管迫切需要針對MERS-CoV和SARS-CoV-2的治療方法，但尚未充分探討為此目的使用VHH的可行性。已報(bào)道了通過對駱駝進(jìn)行抗原免疫產(chǎn)生了幾種靶向MERS-CoV S蛋白的VHH，但是它們的表位除了被歸類為靶向RBD之外，在很大程度上仍然是未知的。

在一項(xiàng)新的研究中，來自比利時(shí)、美國和德國多家研究機(jī)構(gòu)的研究人員分離出兩種分別可強(qiáng)效中和SARS-CoV RBD和MERS-CoV RBD的VHH。這兩種VHH分別是對美洲駝進(jìn)行SARS-CoV S蛋白和MERS-CoV S蛋白免疫而觸發(fā)的。他們解析出這兩種VHH與它們各自的病毒表位形成復(fù)合物時(shí)的晶體結(jié)構(gòu)，這表明中和機(jī)制可能是受體結(jié)合界面受到封閉和將RBD保持在向上構(gòu)象中。相關(guān)研究結(jié)果以論文手稿的形式在線發(fā)表在Cell期刊上，論文標(biāo)題為“Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single-domain Camelid Antibodies”。

這些研究人員還發(fā)現(xiàn)這種靶向SARS-CoV RBD的VHH與SARS-CoV-2 RBD發(fā)生交叉反應(yīng)，并且可以阻斷受體結(jié)合界面。在將這種VHH進(jìn)行基因改造后成為二價(jià)Fc融合蛋白后，他們證實(shí)這種交叉反應(yīng)性的VHH也可以中和攜帶SARS-CoV-2 S蛋白的假病毒。他們進(jìn)一步證實(shí)這種VHH-Fc融合蛋白可以在工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的CHO細(xì)胞系統(tǒng)中高產(chǎn)量產(chǎn)生，這表明作為正在進(jìn)行的COVID-19大流行的潛在治療試劑，它值得進(jìn)一步研究。

由此可見，這些研究人員從接受融合前保持穩(wěn)定的MERS-CoV和SARS-CoV S蛋白免疫的美洲駝中分離出兩種具有強(qiáng)效中和能力的VHH，并對它們進(jìn)行了表征。這兩種VHH能夠與各自S蛋白的RBD高親和力地結(jié)合，能夠在體外中和表達(dá)各自S蛋白的假病毒。就他們所知，人們之前還沒有分離和表征SARS-CoV S蛋白特異性的VHH。幾種MERS-CoV S蛋白特異性的VHH已經(jīng)被描述，它們都是靶向RBD的。這幾種VHH中的一些也已被報(bào)道可以阻斷DPP4結(jié)合，非常類似于MERS VHH-55。通過解析出這兩種新分離的VHH與各自的病毒靶點(diǎn)形成復(fù)合物時(shí)的晶體結(jié)構(gòu)，他們提供了關(guān)于表位結(jié)合及其中和機(jī)制的詳細(xì)見解。

人們已描述了一些靶向RBD的常規(guī)抗體能夠中和SARS-CoV或MERS-CoV。MERS VHH-55的表位與一些靶向MERS-CoV RBD的抗體中的幾種---包括C2、MCA1、m336、JC57-14、D12、4C2和MERS-27---的表位重疊。除了最近描述的也能結(jié)合SARS-CoV S蛋白和SARS-CoV-2 S蛋白的CR3022之外，SARS VHH-72的表位與任何之前描述的抗體的表位沒有明顯重疊。

然而，與SARS VHH-72不同，CR3022不能阻止ACE2結(jié)合，并且它缺乏中和SARS-CoV-2的活性。盡管表位部分重疊，但是這種功能上的差異可能是由于這兩種抗體采用的接近角度不同。鑒于SARS VHH-72以納摩爾解離常數(shù)（nanomolar KD）結(jié)合到SARS-CoV S RBD的一部分表現(xiàn)出較低變異的序列上，而且正如它與WIV1-CoV和SARS-CoV-2 RBD存在交叉反應(yīng)性所證實(shí)的那樣，它可能廣泛地結(jié)合來自其他SARS-CoV樣病毒的S蛋白。

這些研究人員表明，通過基因改造構(gòu)建出二價(jià)VHH-72-Fc融合蛋白，他們可以補(bǔ)償單價(jià)SARS VHH-72的相對較高的解離常數(shù)。這種二價(jià)分子在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的ExpiCHO細(xì)胞中表達(dá)良好(~300 mg/L)，并且能夠在體外中和表達(dá)SARS-CoV-2 S蛋白的假病毒。在未來利用現(xiàn)有的文庫和SARS-CoV-2 S進(jìn)行的篩選工作可能會產(chǎn)生更強(qiáng)的中和劑。

由于VHH內(nèi)在的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，它們已被研究作為一類潛在的治療性藥物來對抗多種疾病。之前已經(jīng)報(bào)道了幾種靶向HIV和流感病毒的VHH，并且有多種靶向RSV的VHH已經(jīng)被評估。通過霧化噴霧給送這些分子的可能性在呼吸道病原體的情況下特別有吸引力，這是因?yàn)閂HH理論上可以直接被吸入到感染部位，以最大限度地提高它們的生物利用度和功能。鑒于目前缺乏治療MERS、SARS和COVID-19的方法，以及與冠狀病毒疫情大爆發(fā)相關(guān)的破壞性影響，人們急需預(yù)防性和治療性的干預(yù)措施。這些研究人員希望MERS VHH-55、SARS VHH-72和VHH-72-Fc因具有良好的生物物理特性和強(qiáng)大的中和能力，可以作為科學(xué)家們的有用試劑和潛在的候選治療性藥物。