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單分子實時測序于海洋生物基因組學研究應用

來源:生物谷作者:人氣:-發表時間:2014-12-05 09:15:00【

自從末端終止法測序技術發明以來,DNA測序技術在短短三十余年內得到迅速發展,科學家們已經向著人類千元(1000 美元)基因組時代發起沖擊。最初由于高昂測序成本的限制,全基因組測序涉及的領域受到限制,只有細菌等基因組很小的生物的全基因組被首先測定,線蟲、果蠅、擬南芥等模式生物的基因組隨后被測定,人類基因組計劃的實施推動了基因組學在全世界的快速發展。這些測序工作都是采用Sanger法進行,項目實施耗時費力。隨著新一代測序技術(Next-generation sequencing, NGS)的出現,越來越多的物種啟動了全基因組測序計劃。基因組研究機構也呈現了多極化發展趨勢,中國成為國際基因組研究的重要一員。新一代測序技術基于新的測序原理,目前,單分子測測序方法日漸占據主導位置。

海洋生物是生物學研究的重要領域,美國自1997 年就開始計劃投資開展羅非魚、對蝦和牡蠣等海洋生物基因組研究。多個海洋藍藻基因組計劃也相繼啟動[8]。隨著海膽基因組項目的完成,目前已有多個海洋生 物基因組計劃啟動或部分完成,中國已經啟動了扁藻、螺旋藻、牡蠣、對蝦等基因組計劃。一般而言,海洋生物基因組大、雜合度高、拼接難度大是研究海洋生物基 因組的最大困擾。

由美國Pacbio公司開發研制的單分子實時測序該通過光學方法直接記錄單個聚合酶在不受干擾的情況下的連續合成,已經使許多極富挑戰性的基因組學研究成 為可能。這種以Pacbio技術為代表的模擬天然DNA復制過程的新型測序方法被稱為第三代測序技術。該技術不僅融合了天然DNA復制高效準確的特點,而 且是可以在不影響聚合酶活性的前提下實時觀測DNA合成,由于聚合酶的平均反應速度可達1bp/s以上,因為其測序速度比Sanger測序快了幾萬倍。目 前已有科學家將單分子實時測序技術用于海洋生物研究:
例證:極地海洋微生物
韓國極地研究所的 Park博士一直致力于極地微生物研究,為了揭示從南極喬治王子島分離得到的Streptomyces菌株的基因組信息(7.6Mb),Park博士的研 究團隊首先利用illumina Hiseq 2000平臺對其基因組進行測序。Streptomyces 的基因組中GC含量高達71%,即使利用Hiseq2000平臺進行了200×深度的測序,仍無法獲得完整的基因組,組裝時產生了185 個contigs,隨后使用Sanger法仍然無法有效的填補gap。
Park博士表示,用其他的短序列測序技術仍然“不可能”填補這種高GC含量的基因組gap,所以他們轉而利用PacBio RS平臺對該基因組進行驗證。由于PacBio RS測序技術具有單分子分辨率,不引入PCR過程,沒有GC偏向性,研究人員利用該技術獲得了高準確度的CCS數據和平均1.5kb的長片段進行基因組組 裝,僅僅對基因組覆蓋15×就能組裝得到26個contig(減少了86%),大大降低了基因組組裝的難度,而且gap也大為減小,使得他們首次獲得了該 細菌的完整基因組信息。
Park博士和他的團隊認為PacBio的單分子實時測序技術“對高GC含量的基因組有著更好的測序能力,并且也是一項非常好的改善de novo測序和組裝的新工具”
Park博士受到該技術的鼓舞,決定繼續利用PacBio技術破解其他極地微生物基因組的組裝難題,挑戰此前“不可能完成的任務”。
極地微生物是一個特殊的群體,它們生存在正常生物無法生存的環境中,對這些微生物進行研究能夠揭示諸如全球氣候變暖、生物進化等方面的問題。此外,這些極 地微生物有著迥異于正常環境微生物群體的代謝類型,能夠幫助人們尋找更加有效的抗生素,有助于發現新型的藥物應用于醫學領域。
例證:北冰洋鱈魚


挪威Oslo大學生態和進化合成中心(CEES)的科研人員用PacBio技術完成了北冰洋鱈魚基因組的拼接工作。北冰洋鱈魚是挪威和其他北歐漁業國家非 常重要的經濟物種,挪威政府一直以來不斷支持鱈魚基因組的測序工作,期望能從中找到關鍵基因,以提高鱈魚養殖業的抗病和高產能力。
鱈魚基因組(830 Mb)測序項目啟動于2008年,由CEES的科學家牽頭,早期投入是在454平臺上用shotgun和mate-pair測序以及基于BAC的 Sanger測序法,但早期組裝結果非常不理想,Contig十萬個以上,Scaffold上千個,平均每個Scaffold中35%都是Gap,這給 Annotation帶來了極大挑戰,科研人員不得不從棘魚等其他魚類的基因信息中獲取參考,來重建鱈魚基因組中丟失的部分,才算發表出了史上第一個北冰 洋鱈魚的基因組Draft。
CEES的科研工作者一直想找個法子優化并升級Draft,尤其是當他們對野生捕獲的鱈魚進行基因組測序并遭遇到雜合性問題時。相比較之前的Draft, 野生鱈魚的基因組中除了SNP不同之外,還出現了大量的幾百甚至幾千bp的插入和缺失,而且還有大量不同的STR,很難跟Draft進行比對。如果不能拿 到Finishing Genome,之前花大量時間和精力拿到的Draft就等于形同虛設了,于是他們被迫選擇了PacBio第三代測序。“當我們把PacBio數據導入到之 前的Draft中去后,大片段甚至是Kb以上級別的Gap就神奇地消失了,我們之前幾年的辛苦在這里瞬間完成了,我們遇到的STR和雜合性問題也迎刃而解 了。我們之前從沒見過如此之快的組裝速度,全程才用了36小時。”參與項目的 Lex Nederbragt教授說道。目前他們正用PacBio數據逐步逐步修復之前靠棘魚等基因數據拼湊的組裝信息,然后全面展開鱈魚基因組比較研究和抗病基 因篩選

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