Jackson ImmunoResearch二抗常見應用之Western Blotting

來源：作者：人氣：-發表時間：2017-02-08 11:18:00【大中小】

Jackson ImmunoResearch二抗產品久經考驗，被眾多文獻使用認證，專業提供適用于Western Blotting的眾多具有種屬特異性的二抗品種，包括辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、生物素標記的抗體及鏈霉親和素，可用于傳統的底物顯色及底物化學發光（ECL）的免疫印跡技術。同時，Jackson ImmunoResearch提供覆蓋紅外光譜范圍的多種染料標記二抗，適用于多色圖片采集處理系統。

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建議操作稀釋范圍及PAP復合物

Jackson ImmunoResearch專業提供親和純化的辣根過氧化物酶—抗辣根過氧化物酶復合物(PAP)，可用于檢測HRP或增強HRP復合物分子的信號。

可溶性PAP復合物	貨號	濃度	規格
山羊Goat PAP	123-005-024	20 mg/ml	0.25 ml
老鼠Mouse PAP	223-005-024	20 mg/ml	0.25 ml
兔Rabbit PAP	323-005-024	20 mg/ml	0.25 ml

Jackson ImmunoResearch標記抗體、鏈霉親和素及PAP復合物建議稀釋范圍如下表所示：

產品	化學發光	顯色
HRP-Antibody	1:10K - 1:200K	1:5K - 1:100K
Alkaline Phosphatase-Antibody	1:5K - 1:50K	1:5K - 1:50K
Biotin-Antibody	1:20K - 1:400K	1:20K - 1:400K
Alexa Fluor® 680 and 790-Antibody	1:50K - 1:200K	1:50K - 1:200K
HRP-Streptavidin	0.01 - 0.1 μg/mL	1 - 2 μg/mL
Alkaline Phosphatase-Streptavidin	0.1 - 1.0 μg/mL	1 - 2 μg/mL
PAP	1:5K - 1:100K	1:5K - 1:100K

WB適用的熒光染料標記二抗

Alexa Fluor®680是一種激發波長702nm，發射波長684nm的遠紅外熒光染料。Alexa Fluor®790為激發波長803nm，發射波長783nm的紅外發光染料（圖1）。由于低熒光猝滅、高消光系數和低的背景熒光，使得抗體結合遠紅外及紅外發光染料比可見光更靈敏。

標記二抗的Alexa Fluor®680和Alexa Fluor®790的激發和發射光譜

圖1 標記二抗的Alexa Fluor®680（左）和Alexa Fluor®790（右）的激發和發射光譜

遠紅外及紅外熒光染料適用于高靈敏度的免疫印跡，定量免疫印跡（quantitative Western blots），凝膠印跡（in-gel Western blots），微印跡分析（microWestern arrays），in-cell Western arrays，on-cell Western arrays microwestern，組織切片成像，小動物全身成像及其他需要強光的技術。

免疫沉淀后WB實驗二抗的選擇

針對免疫沉淀后的Western Blotting研究，Jackson可提供特異性針對輕鏈或Fc片段的抗體，分別檢測分子量50kDa及25kDa以上的抗原。當使用特異性標記重鏈和輕鏈的二抗，如抗IgG（H+L），進行免疫沉淀后的Western Blotting檢測，重鏈與輕鏈的分子量大小分別約為50 kDa、25 kDa（圖2A）。當使用特異性標記輕鏈的IgG輕鏈二抗（圖2B）時，僅結合到一抗的輕鏈上。

圖2 使用HRP標記的羊抗鼠IgG（H+L）能夠檢測出重鏈（50kDa）及輕鏈（25kDa）；而使用特異性針對輕鏈的IgG 輕鏈二抗，即使在IgG過載的情況下，亦不能夠檢測出重鏈。

因此，50kDa左右的蛋白檢測為避免重鏈的干擾，可以選用輕鏈特異性的二抗，從而將IP或者Co-IP中的面臨的重鏈干擾降到較低；同理，25kDa左右的蛋白檢測為避免輕鏈的干擾，可以選用Fc片段特異性的二抗。

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