西寶生物金屬螯合高流速瓊脂糖介質（Ni-IDA QZT 6FF）是將亞氨基二乙酸（IDA）鍵合在高流速瓊脂糖微球上，并螯合金屬離子Ni²⁺而形成的一種親和層析介質。影響蛋白質/多肽與金屬離子螯合力大小的因素主要是蛋白質表面可結合的氨基酸（種類、數目和分布）、金屬離子的種類和密度、層析條件（pH、鹽的種類和濃度、添加劑等）。IMAC具有吸附容量大、選擇性好、分辨率高、易于再生、成本較低等優點，廣泛用于生物制藥和生物工程下游蛋白質、核酸及多肽的分離純化，尤其是組氨酸標記蛋白質的分離純化。

 

表1. Ni-IDA QZT 6FF的理化性質及特征參數

參數	指標
基質	6%交聯瓊脂糖凝膠
配基	-N(CH2COOH)2   (IDA)
形狀	球形
平均粒徑	90 μm (45-165)
金屬離子密度	~40 μmol Ni2+/mL wet gel
動態載量a	~25-30 mg His-Tagged LDH/mL wet gel
推薦流速b	5-10 mL/min   (150-300 cm/h)
流速高達b	20 mL/min (600   cm/h)
耐壓高達b	0.3 MPa (3 bar)
化學穩定性c	0.01 M HCl、0.1 M NaOH（37 °C, 7天）；1 M NaOH、70%乙酸（12   h）；30%異丙醇（30 min）；2% SDS（1 h）
避免使用的試劑	螯合劑，如EDTA、EGTA、檸檬酸等
pH穩定性c	2-14（短期，2 h）；3-12（長期，7天）
儲存條件	20%乙醇，4-30 ℃

樣品：平衡緩沖液中含1mg/mL histidine-tagged LDH（Mr 140000）；

b：流動相為純水，室溫下操作，柱尺寸為10.0*1.6 cm I.D.，CV=20.0 mL。

試劑類型	試劑名稱及濃度
還原試劑	10 mM β-巰基乙醇
變性劑	8 M 尿素、6 M 鹽酸胍
去污劑	2%Triton X-100、2%Tween-20、2%NP-40、2%膽酸鹽、1%CHAPS
緩沖液組分	50 mM 磷酸鈉, pH7.4、100 mM Tris-HCl，pH7.4、100 mM Tris-acetate, pH7.4、100 mM HEPES，pH7.4、100 mM MOPS，pH7.4、100 mM 醋酸鈉，pH7.4
其它試劑	20%乙醇、50%甘油、0.1 M Na2SO4、1.5 M NaCl、1 mM EDTA、60 mM 醋酸

金屬螯合層析可采用重力柱、蠕動泵和層析系統等模式進行操作。以層析系統操作模式為例，層析操作通常包括裝柱、螯合金屬離子、平衡、進料、淋洗、洗脫、再生等步驟（具體操作條件以10.0 * 1.6 cm I.D.，CV=20.0 mL層析柱為例）。

1. 裝柱：

（1）Ni-IDA QZT 6FF介質通常在4 ℃下保存于20%乙醇中，使用前先取出適量（22 mL介質）介質放置于燒杯中，用純水置換掉20%的乙醇溶液，靜置沉降后倒掉部分上清至凝膠濃度約為60%（勻漿液體積約為36 mL），攪拌均勻后備用（勻漿液溫度盡量接近室溫）。

（2）清洗層析柱及配件，排氣泡后擰緊層析柱底端的出口，加入適量純水至0.2-0.5 cm液位高度。

（3）用玻璃棒將介質勻漿液輕輕攪拌均勻（避免引入氣泡），然后用玻璃棒導流將勻漿液沿著柱內壁一次性倒入柱內，盡量避免產生氣泡。介質在層析柱內自由沉降后（30 min），連結好柱子頂端柱頭（預先去除管道內及接口處的氣泡）。

（4）打開泵，先用純水以2.5 mL/min的流速壓柱（10 min至膠面），然后再以4mL/min的流速壓柱，使柱床穩定，調節頂端柱頭至膠面處。用2~3倍柱體積（CV）的緩沖液平衡柱子。

層析柱	裝柱流速（mL/min）		使用流速高值（mL/min）
	第一步	第二步
20 mm×10 mm I.D.	0.9	4.7	2
20 mm×16mm I.D.	2.5	8.7	5
20 mm×26 mm I.D.	6.6	23	13
20 mm×50 mm I.D.	24.5	85	49

（2）選擇合適的金屬離子（Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Fe³⁺等），溶解在中性或弱酸性溶液中，濃度為用0.2 mol/L，過濾后使用，其中Fe³⁺必須在低pH（3.0）下鰲合，以防止Fe³⁺產生沉淀；

3. 平衡：用5-10 CV的平衡緩沖液平衡層析柱，至流出液電導和pH保持不變（與平衡液一致）。實際操作中，一般選用中性/弱堿性（pH 7-8）的高鹽（0.15-1.0 M NaCl或其它中性鹽）緩沖液。其中常用磷酸鹽緩沖體系，如20 mM PB+0.5 M NaCl, pH 7.4。對于結合力較強的帶組氨酸標記的蛋白質，平衡緩沖液中可加入低濃度（5-50 mM）的咪唑（具體濃度需要根據實驗現象進行優化）。

4. 進料：樣品緩沖液應盡可能與平衡液一致。固體樣品可用平衡液溶解配制；低濃度樣品溶液可用平衡液透析；高濃度樣品溶液可用平衡液稀釋。為了避免堵塞層析柱，樣品應經離心或微濾處理。為了減少雜蛋白在層析柱上的吸附，可在確保目標蛋白吸附的情況下適當增加樣品緩沖液中的咪唑（具體濃度根據優化結果確定，并與平衡緩沖液的咪唑濃度保持一致）。

5. 淋洗：上樣完畢后繼續用平衡緩沖液淋洗至基線。

6. 洗脫：一般采用競爭試劑咪唑進行洗脫，并在洗脫緩沖液中加入一定濃度（0.15-1.0 M）的NaCl以抑制離子交換作用。洗脫緩沖液一般為20 mM PB + 0.5 M NaCl + 0.5 M咪唑，pH 7.4。可采用線性梯度或階越式梯度洗脫（洗脫時所需的咪唑濃度與所純化蛋白的結合強度有關，可通過洗脫濃度優化得到）。對于包涵體蛋白，相應地可在平衡、上樣和洗脫的緩沖液中加入8 M Urea或6 M Gua-HCl。洗脫后再對變性蛋白進行復性。

7. 再生：介質使用數次（約3-20次，具體與原料來源、樣品體積等有關）后，或者螯合其它金屬離子前，需要進行再生處理。首先用2-3 CV的純水清洗層析柱，然后用5 CV的20 mM PB + 0.5 M NaCl +50 mM EDTA，pH 7.4淋洗柱子，再分別用5 CV的20 mM PB + 0.5 M NaCl，pH 7.40溶液和5 CV的純水清洗柱子，去除柱上殘留的EDTA。螯合金屬離子的操作按照“3.2”所述進行。若有變性蛋白質或脂類物質在再生過程中未能有效去除，可用在位清洗（cleaning in place, CIP）的方法去除。

8. 原位清洗：為了避免不同樣品間的相互干擾，或者當介質污染比較嚴重時（反壓增加），需要對介質進行在位清洗。在位清洗前，需要預先去除介質上鰲合的金屬離子。在位清洗時，可采用反向沖洗的方法。

（3）對疏水性結合的蛋白、脂蛋白和脂類物質，可用5-10 CV的70%乙醇或30%異丙醇清洗（15-20 min），并用5-10 CV的純水沖洗。

9. 其它注意事項：在使用和保存柱子的時候，要避免柱子流干，氣泡進入。

Ni-IDA QZT 6FF純化His-tag LDH。

層析介質：Ni-IDA QZT 6FF介質（10.0 cm × 1.6 cm I.D., CV=20 mL）；

樣品：His-tag LDH發酵液；

平衡緩沖液：20 mM PB + 0.15 M NaCl + 50 mM 咪唑, pH 7.4；

洗脫緩沖液：20 mM PB + 0.15 M NaCl + 0.5 M 咪唑, pH 7.4；

流速：5 mL/min；

進料量：60 mL。

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