金屬螯合介質（NTA）——層析介質優選西寶生物

來源：作者：人氣：-發表時間：2015-10-16 10:11:00【大中小】

金屬螯合親和層析，又稱固定化金屬離子親和層析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC）。該法利用蛋白質表面的某些氨基酸（如組氨酸、色氨酸、半胱氨酸等）和金屬離子（Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺等過渡金屬離子）發生特殊的相互作用的原理，從而實現蛋白質的分離。

西寶生物金屬螯合高流速瓊脂糖介質（Ni-NTA QZT 6FF）是將次氨基三乙酸（NTA）鍵合在高流速、高強度的瓊脂糖微球上，并螯合金屬離子Ni²⁺而形成的一種親和層析介質。影響蛋白質/多肽與金屬離子螯合力大小的因素主要是蛋白質表面可結合的氨基酸（種類、數目和分布）、金屬離子的種類和密度、層析條件（pH、鹽的種類和濃度、添加劑等）。IMAC具有吸附容量大、選擇性好、分辨率高、易于再生、成本較低等優點，廣泛用于生物制藥和生物工程下游蛋白質、核酸及多肽的分離純化，尤其是組氨酸標記蛋白質的分離純化。

一、產品特性

西寶生物金屬螯合介質（NTA）Ni- NTA QZT 6FF親和介質具有良好的穩定性、生物相容性和溶劑相容性，這不僅有利于保持產品的生物活性和提高產品的收率，還有利于擴大層析操作條件的選擇范圍。Ni- NTA QZT 6FF親和介質的理化性質和溶劑相容性分別如表1和表2所示。

表1. Ni- NTA QZT 6FF的理化性質及特征參數

參數	指標
基質	6%交聯瓊脂糖凝膠
配基	-N(CH2COOH)3 (NTA)
形狀	球形
平均粒徑	90 μm (45-165)
金屬離子密度	~15 μmol Ni²⁺/mL wet gel
動態載量^a	~20-25 mg His-Tagged LDH/mL wet gel
推薦流速^b	5-10 mL/min (150-300 cm/h)
流速高達^b	20 mL/min (600 cm/h)
耐壓高達^b	0.3 MPa (3 bar)
化學穩定性^c	0.01 M HCl、0.1 M NaOH（37 °C, 7天）；1 M NaOH、70%乙酸（12 h）；30%異丙醇（30 min）；2% SDS（1 h）
避免使用的試劑	螯合劑，如EDTA、EGTA、檸檬酸等
pH穩定性^c	2-14（短期，2 h）；3-12（長期，7天）
儲存條件	20%乙醇，4-30 ^oC

動態載量^a：

樣品：平衡緩沖液中含1mg/mL histidine-tagged LDH（Mr 140000）；

計算方法：根據10%穿透點計算介質動態載量（QB, 10%）；

柱體積：5 mL（6.37*1.0 cm I.D.）；

流速：2.5 mL/min；

平衡緩沖液：20mM PB + 0.1M NaCl + 50 mM 咪唑, pH 7.4；

洗脫緩沖液：20mM PB + 0.1M NaCl + 0.5 M 咪唑, pH 7.4；

注意：動態載量與蛋白種類和操作條件密切相關。

b：流動相為純水，室溫下操作，柱尺寸為10.0*1.6 cm I.D.，CV=20.0 mL。

c：未螯合Ni²⁺的介質。

表2 Ni-IDA QZT 6FF和特定濃度試劑的相容性

試劑類型	試劑名稱及濃度
還原試劑	10 mM β-巰基乙醇、5 mM DTT
變性劑	8 M 尿素、6 M 鹽酸胍
去污劑	2%Triton X-100、2%Tween-20、2%NP-40、2%膽酸鹽、1%CHAPS
緩沖液組分	50 mM 磷酸鈉, pH7.4、100 mM Tris-HCl，pH7.4、100 mM Tris-acetate, pH7.4、100 mM HEPES，pH7.4、100 mM MOPS，pH7.4、100 mM 醋酸鈉，pH7.4
其它試劑	20%乙醇、50%甘油、0.1 M Na₂SO₄、1.5 M NaCl、1 mM EDTA、60 mM 醋酸

二、應用范圍

西寶生物金屬螯合介質（NTA）廣泛用于蛋白質、核酸及多肽，尤其是組氨酸標記蛋白質的分離純化。

三、操作步驟

金屬螯合層析可采用重力柱、蠕動泵和層析系統等模式進行操作。以層析系統操作模式為例，層析操作通常包括裝柱、螯合金屬離子、平衡、進料、淋洗、洗脫、再生等步驟（具體操作條件以10.0 * 1.6 cm I.D.，CV=20.0 mL層析柱為例）。

1. 裝柱：

（1）Ni-NTA QZT 6FF介質通常在4 ℃下保存于20%乙醇中，使用前先取出適量（22 mL介質）介質放置于燒杯中，用純水置換掉20%的乙醇溶液，靜置沉降后倒掉部分上清至凝膠濃度約為60%（勻漿液體積約為36 mL），攪拌均勻后備用（勻漿液溫度盡量接近室溫）。

（2）清洗層析柱及配件，排氣泡后擰緊層析柱底端的出口，加入適量純水至0.2-0.5 cm液位高度。

（3）用玻璃棒將介質勻漿液輕輕攪拌均勻（避免引入氣泡），然后用玻璃棒導流將勻漿液沿著柱內壁一次性倒入柱內，盡量避免產生氣泡。介質在層析柱內自由沉降后（30 min），連結好柱子頂端柱頭（預先去除管道內及接口處的氣泡）。

（4）打開泵，先用純水以2.5 mL/min的流速壓柱（10 min至膠面），然后再以4mL/min的流速壓柱，使柱床穩定，調節頂端柱頭至膠面處。用2~3倍柱體積（CV）的緩沖液平衡柱子。

表3 推薦裝柱流速

層析柱	裝柱流速（mL/min）		使用流速高值（mL/min）
層析柱	第一步	第二步	使用流速高值（mL/min）
20 mm×10 mm I.D.	0.9	4.7	2
20 mm×16mm I.D.	2.5	8.7	5
20 mm×26 mm I.D.	6.6	23	13
20 mm×50 mm I.D.	24.5	85	49

2. 螯合金屬離子：本介質可以根據需要，螯合不同的金屬離子，如Cu²⁺、Ni²⁺或Zn²⁺等。Cu²⁺與蛋白質結合強，Ni²⁺與蛋白質結合適中，Zn²⁺與蛋白質結合弱，可根據實際需要選擇。用戶可選擇購買螯合了相應金屬離子的介質（出廠時一般以螯合Ni²⁺的形式提供，此時無需螯合金屬離子步驟），也可自行螯合。具體的鰲合方法如下：

（1）層析柱（未螯合或再生后）用5CV的純水清洗（5 mL/min，下同）；

（2）選擇合適的金屬離子（Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Fe³⁺等），溶解在中性或弱酸性溶液中，濃度為用0.2 mol/L，過濾后使用，其中Fe³⁺必須在低pH（3.0）下鰲合，以防止Fe³⁺產生沉淀；

（3）用5 CV的金屬離子溶液上柱，鰲合金屬離子；

（4）用5 CV以上的純水清洗層析柱，去除游離的金屬離子。

此外，也可以直接把清洗干凈的介質和所要鰲合的金屬離子溶液混合后在搖床上振蕩過夜，鰲合金屬離子，然后再裝柱。

3. 平衡：用5-10 CV的平衡緩沖液平衡層析柱，至流出液電導和pH保持不變（與平衡液一致）。實際操作中，一般選用中性/弱堿性（pH 7-8）的高鹽（0.15-1.0 M NaCl或其它中性鹽）緩沖液。其中常用磷酸鹽緩沖體系，如20 mM PB+0.5 M NaCl, pH 7.4。對于結合力較強的帶組氨酸標記的蛋白質，平衡緩沖液中可加入低濃度（5-50 mM）的咪唑（具體濃度需要根據實驗現象進行優化）。

4. 進料：樣品緩沖液應盡可能與平衡液一致。固體樣品可用平衡液溶解配制；低濃度樣品溶液可用平衡液透析；高濃度樣品溶液可用平衡液稀釋。為了避免堵塞層析柱，樣品應經離心或微濾處理。為了減少雜蛋白在層析柱上的吸附，可在確保目標蛋白吸附的情況下適當增加樣品緩沖液中的咪唑（具體濃度根據優化結果確定，并與平衡緩沖液的咪唑濃度保持一致）。

5. 淋洗：上樣完畢后繼續用平衡緩沖液淋洗至基線。

6. 洗脫：一般采用競爭試劑咪唑進行洗脫，并在洗脫緩沖液中加入一定濃度（0.15-1.0 M）的NaCl以抑制離子交換作用。洗脫緩沖液一般為20 mM PB + 0.5 M NaCl + 0.5 M咪唑，pH 7.4。可采用線性梯度或階越式梯度洗脫（洗脫時所需的咪唑濃度與所純化蛋白的結合強度有關，可通過洗脫濃度優化得到）。對于包涵體蛋白，相應地可在平衡、上樣和洗脫的緩沖液中加入8 M Urea或6 M Gua-HCl。洗脫后再對變性蛋白進行復性。

（備注：洗脫一般有兩種方式：一是采用競爭試劑，如咪唑（0-0.5 M）、組氨酸（0-0.05 M）、氯化銨（0-2 M）等將蛋白質從柱子上置換下來；二是減小pH值，洗脫目標蛋白，大多數蛋白質在pH 4-6的范圍內可被洗下來。用競爭試劑咪唑或減小pH值的方法洗脫蛋白質，金屬離子仍結合在柱子上；若用競爭試劑組氨酸或氯化銨洗脫蛋白質，會將金屬離子和蛋白質的復合物一起洗下來）。

7. 再生：介質使用數次（約3-20次，具體與原料來源、樣品體積等有關）后，或者螯合其它金屬離子前，需要進行再生處理。首先用2-3 CV的純水清洗層析柱，然后用5 CV的20 mM PB + 0.5 M NaCl +50 mM EDTA，pH 7.4淋洗柱子，再分別用5 CV的20 mM PB + 0.5 M NaCl，pH 7.40溶液和5 CV的純水清洗柱子，去除柱上殘留的EDTA。螯合金屬離子的操作按照“3.2”所述進行。若有變性蛋白質或脂類物質在再生過程中未能有效去除，可用在位清洗（cleaning in place, CIP）的方法去除。

8. 原位清洗：為了避免不同樣品間的相互干擾，或者當介質污染比較嚴重時（反壓增加），需要對介質進行在位清洗。在位清洗前，需要預先去除介質上鰲合的金屬離子。在位清洗時，可采用反向沖洗的方法。

（1）對于以離子鍵結合的蛋白，可用2-3 CV以上的2 M NaCl清洗，并用3 CV以上的純水沖洗。

（2）對沉淀蛋白、以疏水性結合的蛋白或脂蛋白，可用1M NaOH清洗（1-2 h），并用5-10 CV平衡液和3 CV以上的純水沖洗。

（3）對疏水性結合的蛋白、脂蛋白和脂類物質，可用5-10 CV的70%乙醇或30%異丙醇清洗（15-20 min），并用5-10 CV的純水沖洗。

此外，也可用2 CV含去污劑的堿性或酸性溶液清洗。如用0.1-0.5%的非離子去污劑+0.1 M乙酸沖洗1-2 h，并用5-10 CV的70%乙醇沖洗去除去污劑，然后用5-10 CV的純水沖洗。

9. 其它注意事項：在使用和保存柱子的時候，要避免柱子流干，氣泡進入。

四、具體應用實例

Ni-NTA QZT 6FF純化His-tag LDH。

層析介質：Ni-NTA QZT 6FF介質（10.0 cm × 1.6 cm I.D., CV=20 mL）；

對照介質（10.0 cm×1.6 cm I.D., CV=20 mL, 某品牌）；

樣品：His-tag LDH發酵液；

平衡緩沖液：20 mM PB + 0.15 M NaCl + 50 mM 咪唑, pH 7.4；

洗脫緩沖液：20 mM PB + 0.15 M NaCl + 0.5 M 咪唑, pH 7.4；

流速：5 mL/min；

進料量：60 mL。

LDH活性回收率均在80~90%，所純化樣品His-tagged LDH純度均達到電泳純。

圖1 西寶生物金屬螯合介質與進口介質的分離效果比較

五、特色服務

（1）提供介質篩選及工藝開發的咨詢。

（2）接受客戶委托開發各種分離介質和分離工藝。

（3）按客戶要求提供各種規格的預裝柱。

（4）為客戶提供售前和售后服務。

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