金屬螯合介質(zhì)（NTA）——層析介質(zhì)優(yōu)選西寶生物

來(lái)源：作者：人氣：-發(fā)表時(shí)間：2015-10-16 10:11:00【大中小】

金屬螯合親和層析，又稱(chēng)固定化金屬離子親和層析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC）。該法利用蛋白質(zhì)表面的某些氨基酸（如組氨酸、色氨酸、半胱氨酸等）和金屬離子（Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺等過(guò)渡金屬離子）發(fā)生特殊的相互作用的原理，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。

西寶生物金屬螯合高流速瓊脂糖介質(zhì)（Ni-NTA QZT 6FF）是將次氨基三乙酸（NTA）鍵合在高流速、高強(qiáng)度的瓊脂糖微球上，并螯合金屬離子Ni²⁺而形成的一種親和層析介質(zhì)。影響蛋白質(zhì)/多肽與金屬離子螯合力大小的因素主要是蛋白質(zhì)表面可結(jié)合的氨基酸（種類(lèi)、數(shù)目和分布）、金屬離子的種類(lèi)和密度、層析條件（pH、鹽的種類(lèi)和濃度、添加劑等）。IMAC具有吸附容量大、選擇性好、分辨率高、易于再生、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于生物制藥和生物工程下游蛋白質(zhì)、核酸及多肽的分離純化，尤其是組氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)的分離純化。

一、產(chǎn)品特性

西寶生物金屬螯合介質(zhì)（NTA）Ni- NTA QZT 6FF親和介質(zhì)具有良好的穩(wěn)定性、生物相容性和溶劑相容性，這不僅有利于保持產(chǎn)品的生物活性和提高產(chǎn)品的收率，還有利于擴(kuò)大層析操作條件的選擇范圍。Ni- NTA QZT 6FF親和介質(zhì)的理化性質(zhì)和溶劑相容性分別如表1和表2所示。

表1. Ni- NTA QZT 6FF的理化性質(zhì)及特征參數(shù)

參數(shù)	指標(biāo)
基質(zhì)	6%交聯(lián)瓊脂糖凝膠
配基	-N(CH2COOH)3 (NTA)
形狀	球形
平均粒徑	90 μm (45-165)
金屬離子密度	~15 μmol Ni²⁺/mL wet gel
動(dòng)態(tài)載量^a	~20-25 mg His-Tagged LDH/mL wet gel
推薦流速^b	5-10 mL/min (150-300 cm/h)
流速高達(dá)^b	20 mL/min (600 cm/h)
耐壓高達(dá)^b	0.3 MPa (3 bar)
化學(xué)穩(wěn)定性^c	0.01 M HCl、0.1 M NaOH（37 °C, 7天）；1 M NaOH、70%乙酸（12 h）；30%異丙醇（30 min）；2% SDS（1 h）
避免使用的試劑	螯合劑，如EDTA、EGTA、檸檬酸等
pH穩(wěn)定性^c	2-14（短期，2 h）；3-12（長(zhǎng)期，7天）
儲(chǔ)存條件	20%乙醇，4-30 ^oC

動(dòng)態(tài)載量^a：

樣品：平衡緩沖液中含1mg/mL histidine-tagged LDH（Mr 140000）；

計(jì)算方法：根據(jù)10%穿透點(diǎn)計(jì)算介質(zhì)動(dòng)態(tài)載量（QB, 10%）；

柱體積：5 mL（6.37*1.0 cm I.D.）；

流速：2.5 mL/min；

平衡緩沖液：20mM PB + 0.1M NaCl + 50 mM 咪唑, pH 7.4；

洗脫緩沖液：20mM PB + 0.1M NaCl + 0.5 M 咪唑, pH 7.4；

注意：動(dòng)態(tài)載量與蛋白種類(lèi)和操作條件密切相關(guān)。

b：流動(dòng)相為純水，室溫下操作，柱尺寸為10.0*1.6 cm I.D.，CV=20.0 mL。

c：未螯合Ni²⁺的介質(zhì)。

表2 Ni-IDA QZT 6FF和特定濃度試劑的相容性

試劑類(lèi)型	試劑名稱(chēng)及濃度
還原試劑	10 mM β-巰基乙醇、5 mM DTT
變性劑	8 M 尿素、6 M 鹽酸胍
去污劑	2%Triton X-100、2%Tween-20、2%NP-40、2%膽酸鹽、1%CHAPS
緩沖液組分	50 mM 磷酸鈉, pH7.4、100 mM Tris-HCl，pH7.4、100 mM Tris-acetate, pH7.4、100 mM HEPES，pH7.4、100 mM MOPS，pH7.4、100 mM 醋酸鈉，pH7.4
其它試劑	20%乙醇、50%甘油、0.1 M Na₂SO₄、1.5 M NaCl、1 mM EDTA、60 mM 醋酸

二、應(yīng)用范圍

西寶生物金屬螯合介質(zhì)（NTA）廣泛用于蛋白質(zhì)、核酸及多肽，尤其是組氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)的分離純化。

三、操作步驟

金屬螯合層析可采用重力柱、蠕動(dòng)泵和層析系統(tǒng)等模式進(jìn)行操作。以層析系統(tǒng)操作模式為例，層析操作通常包括裝柱、螯合金屬離子、平衡、進(jìn)料、淋洗、洗脫、再生等步驟（具體操作條件以10.0 * 1.6 cm I.D.，CV=20.0 mL層析柱為例）。

1. 裝柱：

（1）Ni-NTA QZT 6FF介質(zhì)通常在4 ℃下保存于20%乙醇中，使用前先取出適量（22 mL介質(zhì)）介質(zhì)放置于燒杯中，用純水置換掉20%的乙醇溶液，靜置沉降后倒掉部分上清至凝膠濃度約為60%（勻漿液體積約為36 mL），攪拌均勻后備用（勻漿液溫度盡量接近室溫）。

（2）清洗層析柱及配件，排氣泡后擰緊層析柱底端的出口，加入適量純水至0.2-0.5 cm液位高度。

（3）用玻璃棒將介質(zhì)勻漿液輕輕攪拌均勻（避免引入氣泡），然后用玻璃棒導(dǎo)流將勻漿液沿著柱內(nèi)壁一次性倒入柱內(nèi)，盡量避免產(chǎn)生氣泡。介質(zhì)在層析柱內(nèi)自由沉降后（30 min），連結(jié)好柱子頂端柱頭（預(yù)先去除管道內(nèi)及接口處的氣泡）。

（4）打開(kāi)泵，先用純水以2.5 mL/min的流速壓柱（10 min至膠面），然后再以4mL/min的流速壓柱，使柱床穩(wěn)定，調(diào)節(jié)頂端柱頭至膠面處。用2~3倍柱體積（CV）的緩沖液平衡柱子。

表3 推薦裝柱流速

層析柱	裝柱流速（mL/min）		使用流速高值（mL/min）
層析柱	第一步	第二步	使用流速高值（mL/min）
20 mm×10 mm I.D.	0.9	4.7	2
20 mm×16mm I.D.	2.5	8.7	5
20 mm×26 mm I.D.	6.6	23	13
20 mm×50 mm I.D.	24.5	85	49

2. 螯合金屬離子：本介質(zhì)可以根據(jù)需要，螯合不同的金屬離子，如Cu²⁺、Ni²⁺或Zn²⁺等。Cu²⁺與蛋白質(zhì)結(jié)合強(qiáng)，Ni²⁺與蛋白質(zhì)結(jié)合適中，Zn²⁺與蛋白質(zhì)結(jié)合弱，可根據(jù)實(shí)際需要選擇。用戶(hù)可選擇購(gòu)買(mǎi)螯合了相應(yīng)金屬離子的介質(zhì)（出廠時(shí)一般以螯合Ni²⁺的形式提供，此時(shí)無(wú)需螯合金屬離子步驟），也可自行螯合。具體的鰲合方法如下：

（1）層析柱（未螯合或再生后）用5CV的純水清洗（5 mL/min，下同）；

（2）選擇合適的金屬離子（Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Fe³⁺等），溶解在中性或弱酸性溶液中，濃度為用0.2 mol/L，過(guò)濾后使用，其中Fe³⁺必須在低pH（3.0）下鰲合，以防止Fe³⁺產(chǎn)生沉淀；

（3）用5 CV的金屬離子溶液上柱，鰲合金屬離子；

（4）用5 CV以上的純水清洗層析柱，去除游離的金屬離子。

此外，也可以直接把清洗干凈的介質(zhì)和所要鰲合的金屬離子溶液混合后在搖床上振蕩過(guò)夜，鰲合金屬離子，然后再裝柱。

3. 平衡：用5-10 CV的平衡緩沖液平衡層析柱，至流出液電導(dǎo)和pH保持不變（與平衡液一致）。實(shí)際操作中，一般選用中性/弱堿性（pH 7-8）的高鹽（0.15-1.0 M NaCl或其它中性鹽）緩沖液。其中常用磷酸鹽緩沖體系，如20 mM PB+0.5 M NaCl, pH 7.4。對(duì)于結(jié)合力較強(qiáng)的帶組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)，平衡緩沖液中可加入低濃度（5-50 mM）的咪唑（具體濃度需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行優(yōu)化）。

4. 進(jìn)料：樣品緩沖液應(yīng)盡可能與平衡液一致。固體樣品可用平衡液溶解配制；低濃度樣品溶液可用平衡液透析；高濃度樣品溶液可用平衡液稀釋。為了避免堵塞層析柱，樣品應(yīng)經(jīng)離心或微濾處理。為了減少雜蛋白在層析柱上的吸附，可在確保目標(biāo)蛋白吸附的情況下適當(dāng)增加樣品緩沖液中的咪唑（具體濃度根據(jù)優(yōu)化結(jié)果確定，并與平衡緩沖液的咪唑濃度保持一致）。

5. 淋洗：上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液淋洗至基線(xiàn)。

6. 洗脫：一般采用競(jìng)爭(zhēng)試劑咪唑進(jìn)行洗脫，并在洗脫緩沖液中加入一定濃度（0.15-1.0 M）的NaCl以抑制離子交換作用。洗脫緩沖液一般為20 mM PB + 0.5 M NaCl + 0.5 M咪唑，pH 7.4?？刹捎镁€(xiàn)性梯度或階越式梯度洗脫（洗脫時(shí)所需的咪唑濃度與所純化蛋白的結(jié)合強(qiáng)度有關(guān)，可通過(guò)洗脫濃度優(yōu)化得到）。對(duì)于包涵體蛋白，相應(yīng)地可在平衡、上樣和洗脫的緩沖液中加入8 M Urea或6 M Gua-HCl。洗脫后再對(duì)變性蛋白進(jìn)行復(fù)性。

（備注：洗脫一般有兩種方式：一是采用競(jìng)爭(zhēng)試劑，如咪唑（0-0.5 M）、組氨酸（0-0.05 M）、氯化銨（0-2 M）等將蛋白質(zhì)從柱子上置換下來(lái)；二是減小pH值，洗脫目標(biāo)蛋白，大多數(shù)蛋白質(zhì)在pH 4-6的范圍內(nèi)可被洗下來(lái)。用競(jìng)爭(zhēng)試劑咪唑或減小pH值的方法洗脫蛋白質(zhì)，金屬離子仍結(jié)合在柱子上；若用競(jìng)爭(zhēng)試劑組氨酸或氯化銨洗脫蛋白質(zhì)，會(huì)將金屬離子和蛋白質(zhì)的復(fù)合物一起洗下來(lái)）。

7. 再生：介質(zhì)使用數(shù)次（約3-20次，具體與原料來(lái)源、樣品體積等有關(guān)）后，或者螯合其它金屬離子前，需要進(jìn)行再生處理。首先用2-3 CV的純水清洗層析柱，然后用5 CV的20 mM PB + 0.5 M NaCl +50 mM EDTA，pH 7.4淋洗柱子，再分別用5 CV的20 mM PB + 0.5 M NaCl，pH 7.40溶液和5 CV的純水清洗柱子，去除柱上殘留的EDTA。螯合金屬離子的操作按照“3.2”所述進(jìn)行。若有變性蛋白質(zhì)或脂類(lèi)物質(zhì)在再生過(guò)程中未能有效去除，可用在位清洗（cleaning in place, CIP）的方法去除。

8. 原位清洗：為了避免不同樣品間的相互干擾，或者當(dāng)介質(zhì)污染比較嚴(yán)重時(shí)（反壓增加），需要對(duì)介質(zhì)進(jìn)行在位清洗。在位清洗前，需要預(yù)先去除介質(zhì)上鰲合的金屬離子。在位清洗時(shí)，可采用反向沖洗的方法。

（1）對(duì)于以離子鍵結(jié)合的蛋白，可用2-3 CV以上的2 M NaCl清洗，并用3 CV以上的純水沖洗。

（2）對(duì)沉淀蛋白、以疏水性結(jié)合的蛋白或脂蛋白，可用1M NaOH清洗（1-2 h），并用5-10 CV平衡液和3 CV以上的純水沖洗。

（3）對(duì)疏水性結(jié)合的蛋白、脂蛋白和脂類(lèi)物質(zhì)，可用5-10 CV的70%乙醇或30%異丙醇清洗（15-20 min），并用5-10 CV的純水沖洗。

此外，也可用2 CV含去污劑的堿性或酸性溶液清洗。如用0.1-0.5%的非離子去污劑+0.1 M乙酸沖洗1-2 h，并用5-10 CV的70%乙醇沖洗去除去污劑，然后用5-10 CV的純水沖洗。

9. 其它注意事項(xiàng)：在使用和保存柱子的時(shí)候，要避免柱子流干，氣泡進(jìn)入。

四、具體應(yīng)用實(shí)例

Ni-NTA QZT 6FF純化His-tag LDH。

層析介質(zhì)：Ni-NTA QZT 6FF介質(zhì)（10.0 cm × 1.6 cm I.D., CV=20 mL）；

對(duì)照介質(zhì)（10.0 cm×1.6 cm I.D., CV=20 mL, 某品牌）；

樣品：His-tag LDH發(fā)酵液；

平衡緩沖液：20 mM PB + 0.15 M NaCl + 50 mM 咪唑, pH 7.4；

洗脫緩沖液：20 mM PB + 0.15 M NaCl + 0.5 M 咪唑, pH 7.4；

流速：5 mL/min；

進(jìn)料量：60 mL。

LDH活性回收率均在80~90%，所純化樣品His-tagged LDH純度均達(dá)到電泳純。

圖1 西寶生物金屬螯合介質(zhì)與進(jìn)口介質(zhì)的分離效果比較

五、特色服務(wù)

（1）提供介質(zhì)篩選及工藝開(kāi)發(fā)的咨詢(xún)。

（2）接受客戶(hù)委托開(kāi)發(fā)各種分離介質(zhì)和分離工藝。

（3）按客戶(hù)要求提供各種規(guī)格的預(yù)裝柱。

（4）為客戶(hù)提供售前和售后服務(wù)。

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