基因編輯器CRISPR的產生和發展

來源：作者：人氣：-發表時間：2016-11-24 09:42:00【大中小】

最先提出使用工具的人Michael Wiles

2013年年初，Michael Wiles同美國緬因州杰克遜實驗室的高層管理者坐在一起，并且告訴了他們一種擁有驚人威力的DNA剪切新方法。這家簡稱為JAX的實驗室利用基因工程技術改造以JAXR Mice為注冊商標的小鼠，并將其出售給研究人員。它喜歡這樣自夸：這“是全世界質量最好和發表次數最多的小鼠模型”。Wiles為該實驗室評估和研發新技術。他相信，這個由細菌和古生菌用于保護自身免受病毒侵襲的免疫策略巧妙改編而來的新工具將使JAX改造小鼠的方式發生革命性變化。“在場的十幾個人中，有9個人睡著了。”Wiles表示，“當時沒人聽說過CRISPR。”

最先提出使用CRISPR工具的人Michael Wiles

Rudolf Jaenisch 在1974 年培育出首個轉基因小鼠，并且首次證明了CRISPR 在產生基因敲除小鼠方面的威力

如今，絕大多數小鼠培育者都知道CRISPR。長久以來，JAX和其他培育新的小鼠品系的實驗室依賴于一個辛苦費力的多步驟過程，其中涉及利用基因工程技術改變小鼠的胚胎干細胞，將其注射進胚胎，并且培育若干代小鼠。即便是JAX最好的團隊，也需要用2年時間才能成功改造一只小鼠。CRISPR利用一種可在受精卵上開展針對性基因手術的分子復合物替代了所有這一切。它能在6個月內產生一種被改造的小鼠。

通過基因改造使基因被敲除或遺傳信息被添加進來的小鼠，成為從癌癥、動脈粥樣硬化到阿爾茨海默氏癥、骨關節炎、肌肉萎縮癥和帕金森氏癥等一系列人類疾病的關鍵研究模型。基因敲除和敲入小鼠還為研究特定基因的功能提供了一種強大的工具。

“當你在以前培育基因敲除小鼠時，需要具備一些技能。”來自麻省理工學院的Rudolf Jaenisch表示，“現在，你不再需要這些技能。任何傻瓜都能做。”

在科學界影響巨大

CRISPR代表的是“成簇的、規律間隔的短回文重復序列”。它源自原核生物遺傳物質，并且是對后者的一種描述。CRISPR利用向導RNA將生物“剪刀”（通常是和CRISPR相關的蛋白——Cas9）傳送到基因組中的某個精確位置。一旦Cas9通過酶解進行了剪切，細胞便會嘗試愈合受傷的DNA。一種修復機制會導致基因敲除，而另一種會導致基因敲入。“CRISPR所做的全部事情是剪切DNA。”Wiles介紹說，“其他一些事情都是細胞修復系統完成的。這就是我們能搭便車的地方。”

細胞的標準反應是試圖將斷點處的雙鏈DNA重新拼接起來。這通常需要吞噬掉或添加一些堿基，從而導致基因插入或刪除。實際上，這種修復努力會將一些小“排印錯誤”引入DNA文本，從而使基因喪失功能。

CRISPR基因敲除

Jaenisch首次證明了CRISPR在產生基因敲除小鼠方面的威力。在研究人員首次證實CRISPR在哺乳動物細胞中奏效的5個月后，Jaenisch和同事于2013年5月在《細胞》雜志上發表了一篇論文。他們報告稱，該技術成功斷開了一組小鼠胚胎干細胞中的5個基因，而這在以前是不可能的。更重要的是，他們證實可完全繞過胚胎干細胞，并且同時敲除單細胞小鼠受精卵中的兩個基因。研究人員不再需要改造胚胎干細胞并不辭辛苦地培育若干代小鼠，以產生卵子或精子細胞中攜帶基因突變的小鼠。同時，研究人員若想培育擁有兩個突變的小鼠，也不再需要將單突變體雜交并經歷一個類似的耗時且煩瑣的流程，以獲得擁有被改變生殖細胞系的小鼠后代。

革命性意義

CRISPR的影響不能僅通過節省成本來衡量。此項技術的便利和速度使得在匆忙之中改造小鼠成為可能，從而解決了來自多倫多病童醫院的C. C. Hui最近面臨的特定問題：在基因敲除過程中，缺失基因未產生任何可觀察到的效應。Hui意識到，被敲除的基因同另一個可能對其作出補償的基因存在關聯。他向在多倫多表型基因組學中心監管小鼠培育的Lauryl Nutter求援。Nutter利用CRISPR使來自初始基因敲除過程的受精卵中的干擾基因發生突變。“我們獲得了受精卵，將CRISPR-Cas9注射進去。8周后，Hui便獲得了雙突變體。”Nutter介紹說，“如果利用胚胎干細胞，可能需要好幾年才能完成。”

這場革命不只限于培育擁有生殖細胞系突變的小鼠。CRISPR還允許研究人員同時使若干疑似癌癥基因在成年小鼠體細胞中發生突變。與此同時，CRISPR敲入可修正成年小鼠體內引發疾病的基因缺陷，比如導致血友病和鐮狀細胞性貧血的突變。若干研究小組計劃將CRISPR注射進正在發育的小鼠體內，目標則是創建可發揮條形碼作用的突變并且使科學家得以追蹤細胞分化時的細胞譜系。

諸如多倫多表型基因組學中心、JAX等小鼠培育公司希望，CRISPR將極大地擴展它們產生的突變范圍。“現在，我可以獲得擁有3處基因改造的異乎尋常的小鼠，并能再次改造它。”Wiles介紹說，“我們無法利用胚胎干細胞進行連續的基因改造。我們可以將一只擁有兩處基因改造的小鼠同另一只擁有兩處基因改造的小鼠雜交，但獲得全部4處基因改造需要數年時間。”

任重而道遠

不過，從某個方面來說，CRISPR革命步履蹣跚。在Jaenisch實驗室首次報告CRISPR的3個月后，他和同事在發表于《細胞》雜志的第二篇論文中提出，CRISPR可輕易實施更加復雜的基因手術，即敲入DNA片段而非簡單地令基因喪失功能。作為示范，他們利用CRISPR將熒光標記敲入小鼠受精卵。當特定基因被開啟時，熒光標記便會亮起。研究人員還創建了對很多研究來說至關重要的條件突變體。

約1/3的小鼠基因對于胚胎發育是必不可少的。如果這些基因從一開始就喪失功能，小鼠便不會誕生。因此，利用胚胎干細胞開展研究的科學家巧妙地設計出一種被稱為Cre-Lox 重組的系統。該系統僅在小鼠發育到足以在失去上述基因仍能存活下來后才會將基因敲除。這需要添加額外的DNA：位于靶基因兩側的Lox序列和一個Cre基因。其中，Cre基因可被啟動，以產生一種酶，用于修改Lox位點之間的DNA。Jaenisch團隊利用CRISPR將同一系統插入受精卵，并且報告稱以相對較高的效率培育出條件小鼠——約16%的受精卵產生了擁有正確突變的小鼠幼崽。

雖然在英國惠康基金會桑格研究所領導一個團隊培育突變小鼠胚胎干細胞的William Skarnes是為Jaenisch的最初報告所折服的眾多研究人員之一，但當他試圖將該技術帶入自己的實驗室時卻感到了失望。“從他的論文看，這項技術很簡單。我非常有信心，它將淘汰掉胚胎干細胞。”Skarnes表示，“但令人失望的是，我們沒有人能重現Jaenisch所報告的效率。在JAX實驗室，產生擁有正確突變的小鼠幼崽的受精卵僅占1%或2%。同時，很多項目正走向失敗。很明顯，它并未被證實為一種穩健的方法。”

無論目前CRISPR看上去有何種缺點，Wiles強調說，它在改造小鼠方面的潛力不應當被忽視。“CRISPR能做的事情有很多，而我們才剛剛開始入門。”