摘要:科學(xué)家展示了一種方法,可以大量生產(chǎn)導(dǎo)致COVID-19的病毒SARS-CoV-2在人體細(xì)胞表面結(jié)合的受體。
美國(guó)能源部布魯克海文國(guó)家實(shí)驗(yàn)室和哥倫比亞大學(xué)的一組科學(xué)家展示了一種生產(chǎn)大量受體的方法,這種受體是導(dǎo)致COVID-19的病毒SARS-CoV-2在人體細(xì)胞表面結(jié)合的受體?,F(xiàn)在臭名昭著的病毒刺突蛋白與人類“ACE2”受體之間的結(jié)合是病毒感染的第一步。在小鼠細(xì)胞中制造功能性人類ACE2蛋白給科學(xué)家們提供了一種研究這些受體的新方法,并有可能將它們投入使用。此外,正如剛剛發(fā)表在《病毒學(xué)》(Virology)雜志上的一篇論文所描述的那樣,這種方法可以促進(jìn)其他被證明難以通過(guò)其他方式產(chǎn)生的復(fù)雜蛋白質(zhì)的研究。
布魯克海文大學(xué)的科學(xué)家們?cè)谝咔樵缙诘淖畛跄繕?biāo)是制造大量的人類ACE2,然后將這種蛋白質(zhì)附著在納米顆粒上。然后可以測(cè)試ace2包被的納米顆粒作為抗病毒治療藥物和/或作為檢測(cè)病毒顆粒的傳感器。
圖1 小鼠纖維細(xì)胞的人ACE2蛋白的過(guò)度表達(dá)在人ACE2基因協(xié)助下穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染
布魯克海文實(shí)驗(yàn)室病毒學(xué)家Paul Freimuth與布魯克海文實(shí)驗(yàn)室功能納米材料中心(CFN)的科學(xué)家合作領(lǐng)導(dǎo)了這項(xiàng)研究,他說(shuō):“對(duì)于這些應(yīng)用中的任何一種,你都需要大量的蛋白質(zhì),而且蛋白質(zhì)必須具有完整的功能。”“但是制造像ACE2這樣的功能性膜蛋白特別具有挑戰(zhàn)性,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在細(xì)胞膜上定位的過(guò)程很復(fù)雜。”
一個(gè)原因是這些蛋白質(zhì)在合成后和插入細(xì)胞膜之前以各種方式被修飾。特別是,添加到蛋白質(zhì)中的碳水化合物分子在長(zhǎng)蛋白質(zhì)鏈如何折疊成最終的3D結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)如何在膜中發(fā)揮作用方面起著關(guān)鍵作用。
“碳水化合物約占ACE2蛋白質(zhì)量的三分之一,”Freimuth說(shuō)。
科學(xué)家用來(lái)人工合成蛋白質(zhì)的最簡(jiǎn)單的細(xì)胞,即細(xì)菌,缺乏附著這些碳水化合物附加物的酶。因此,布魯克海文的研究小組轉(zhuǎn)向了老鼠的細(xì)胞,作為哺乳動(dòng)物,老鼠更像我們,因此能夠進(jìn)行同樣的碳水化合物處理。眾所周知,小鼠細(xì)胞擅長(zhǎng)拾取和表達(dá)“外來(lái)”基因。雖然小鼠細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生ACE2受體,但小鼠版本的這種蛋白質(zhì)不會(huì)與SARS-CoV-2刺突結(jié)合。這意味著科學(xué)家們將有一個(gè)簡(jiǎn)單的方法來(lái)觀察小鼠細(xì)胞是否產(chǎn)生人類ACE2蛋白——通過(guò)觀察刺突是否與細(xì)胞結(jié)合。
ACE2基因的發(fā)現(xiàn)和表達(dá)
為了增加小鼠細(xì)胞整合并正確讀取人類ACE2基因的機(jī)會(huì),研究小組使用了完整的基因。人類和其他“高等生物”的基因除了編碼構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的DNA序列外,還包含大量信息。這些額外的信息有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞染色體內(nèi)的基因結(jié)構(gòu)和功能。
科學(xué)家們搜索了作為人類基因組計(jì)劃的一部分而生成的克隆DNA片段文庫(kù),找到了包含完整ACE2基因的片段,并完成了其嵌入的調(diào)控信息。人類基因組計(jì)劃是美國(guó)能源部資助的一項(xiàng)努力,旨在繪制出人類所有基因的位置。然后,他們將小鼠細(xì)胞暴露在涂有這種DNA片段和另一種蛋白質(zhì)基因的納米顆粒中,這種蛋白質(zhì)使細(xì)胞對(duì)致命的抗生素具有抵抗力。
“在這種情況下,納米顆粒充當(dāng)DNA遞送劑,被細(xì)胞吞噬,這樣DNA就有可能整合到小鼠細(xì)胞染色體中,”Freimuth說(shuō)。“為了找到攜帶外源基因的細(xì)胞,我們將抗生素添加到細(xì)胞培養(yǎng)中。那些不能吸收和表達(dá)抗生素抗性基因的細(xì)胞死亡,而那些獲得抗生素抗性的細(xì)胞存活下來(lái)并生長(zhǎng)成菌落。”
科學(xué)家們將其中大約50個(gè)菌落擴(kuò)展到單個(gè)培養(yǎng)中,然后對(duì)它們進(jìn)行測(cè)試,以確定有多少菌落也攜帶了人類ACE2基因并產(chǎn)生了人類受體蛋白。
檢測(cè)蛋白質(zhì)產(chǎn)量
“大約70%的耐抗生素菌落在細(xì)胞表面表達(dá)人類ACE2蛋白,”Freimuth說(shuō)。“進(jìn)一步的分析表明,這些菌落平均含有28份人類ACE2基因。”
重要的是,小鼠細(xì)胞保留了“外源”ACE2基因拷貝,并在至少90代細(xì)胞中持續(xù)制造由這些基因編碼的人類ACE2蛋白。
細(xì)胞產(chǎn)生的人類ACE2蛋白水平通常與整合到小鼠基因組中的ACE2基因拷貝數(shù)成正比。一些克隆的小鼠細(xì)胞產(chǎn)生的ACE2是正常小鼠細(xì)胞的50倍。
科學(xué)家們使用了多種方法來(lái)測(cè)試小鼠制造的人類ACE2蛋白是否具有功能。其中包括證明含有COVID刺突蛋白的“假病毒”(即sars - cov -2的非致病性替代品)可以與受體結(jié)合并感染細(xì)胞。
“這些傳染性試驗(yàn)表明,在這些小鼠細(xì)胞上表達(dá)的人類ACE2蛋白是完全有效的,”Freimuth說(shuō)。
用途及影響
與此同時(shí),來(lái)自CFN的共同作者Oleg Gang和Feiyue Teng探索了多種方法來(lái)制造富含人類ACE2的細(xì)胞外納米囊泡,以潛在地治療COVID-19。他們還在研究將ACE2蛋白放置在納米顆粒上,用于治療感染或快速檢測(cè)病毒。
“基于ace2的納米囊泡面臨的挑戰(zhàn)在于增強(qiáng)其對(duì)SARS-CoV-2的中和作用。我們還在尋找增強(qiáng)和利用ace2偶聯(lián)納米顆粒的結(jié)合敏感性和特異性的方法,使其對(duì)病毒診斷有用。這兩種方法都需要未來(lái)的優(yōu)化努力,”Teng說(shuō),他是CFN的一名研究助理,廣泛研究了這項(xiàng)研究的生物學(xué)方面和潛在的基于納米科學(xué)的應(yīng)用。
“我們很高興將納米材料制造的進(jìn)步與生物分子方法相結(jié)合,以開(kāi)發(fā)新的治療和傳感策略,”Gang說(shuō),他在哥倫比亞大學(xué)擔(dān)任聯(lián)合職位。“這項(xiàng)研究使我們能夠克服一些方法上的問(wèn)題,因?yàn)榧{米材料和生物系統(tǒng)需要完全不同的表征方法。我們?cè)谶@里學(xué)到的東西對(duì)我們下一步加強(qiáng)基于納米粒子的生物傳感很重要。”
除了使重組ACE2蛋白的應(yīng)用成為可能之外,這項(xiàng)工作還展示了一種生產(chǎn)多種復(fù)雜蛋白的新方法。例如,介導(dǎo)無(wú)數(shù)生物和疾病過(guò)程的大量細(xì)胞表面受體,以及工業(yè)上重要的蛋白質(zhì),如單克隆抗體和酶。
Freimuth說(shuō):“我們的方法是使用完整的基因和小鼠細(xì)胞,這些細(xì)胞可以適應(yīng)在巨大的懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng),就像用于培養(yǎng)細(xì)菌的液體肉湯培養(yǎng)一樣,可以促進(jìn)這些蛋白質(zhì)和其他重要蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)。”
這項(xiàng)研究得到了實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)研究和開(kāi)發(fā)基金的支持,并使用了布魯克海文國(guó)家實(shí)驗(yàn)室功能納米材料中心(CFN)的資源。CFN是美國(guó)能源部科學(xué)辦公室的用戶設(shè)施,由科學(xué)辦公室(BES)支持。
參考資料
[1] Overexpression of human ACE2 protein in mouse fibroblasts stably transfected with the intact ACE2 gene