乙型肝炎病毒（HBV），簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科（Hepadnavividae），可導(dǎo)致肝硬化和肝癌的發(fā)生，給全球帶來嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道，全球有20多億人曾受到過乙型肝炎病毒（HBV）感染，大約3.5億至4億人罹患慢性乙肝病毒（HBV）感染，在亞洲和非洲發(fā)病率尤其高。我國的乙肝病毒感染率約60%-70%；乙肝表面抗原攜帶率約占總?cè)丝诘?.18%，以此計(jì)算，全國約有9300萬人攜帶乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例。

盡管現(xiàn)有的抗病毒藥物可以控制乙型肝炎病毒，但卻不能完全清除它。因此，一旦停止治療患者肝臟中的HBV會(huì)重新活化。這是因?yàn)閏ccDNA “匿藏”在細(xì)胞核中。

細(xì)胞外的乙型肝炎病毒DNA是一種松弛環(huán)狀的雙鏈DNA（relaxed circularDNA，rcDNA）分子。HBV的基因組（rcDNA）進(jìn)入到細(xì)胞核后，rcDNA在病毒蛋白和宿主細(xì)胞因子的幫助下修復(fù)成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。cccDNA是乙肝病毒前基因組RNA復(fù)制的原始模板。

只要還存在于肝細(xì)胞中，乙肝病毒cccDNA的復(fù)制就不會(huì)停止，并與病毒蛋白裝配成新的完整HBV病毒顆粒，以芽生的方式再感染健康的肝細(xì)胞，而這是導(dǎo)致 乙肝復(fù)發(fā)的根本原因。因此，盡管每個(gè)肝細(xì)胞內(nèi)只有約5～50個(gè)cccDNA拷貝，但是只要這些cccDNA池穩(wěn)定，就可以使得病毒的持續(xù)感染延續(xù)，因而清 除肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA是乙肝徹底治愈所必需的。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向結(jié)合特異性的DNA序列，誘導(dǎo)靶DNA雙鏈發(fā)生精確切割。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，這樣的切割能夠被一種被稱作非同源末端連接（non-homologous end-joining, NHEJ）的緊急修復(fù)系統(tǒng)快速地修復(fù)。NHEJ是高效的，但是并不很準(zhǔn)確，因而經(jīng)常導(dǎo)致一些DNA堿基在修復(fù)位點(diǎn)上插入或剔除。鑒于每次讀取DNA時(shí)是按密碼子（每個(gè)密碼子由連續(xù)的三個(gè)堿基組成）讀取的，在關(guān)鍵位點(diǎn)上發(fā)生的這些小的DNA序列變化經(jīng)常破壞相應(yīng)的基因和它的蛋白產(chǎn)物的功能。基于，世界各地的研究人員嘗試?yán)肅RISPR/Cas9系統(tǒng)治療HBV感染，并且取得重大進(jìn)展。

1. Sci Rep：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)高效地抑制HBV
Scientific Reports, 02 June 2015, doi:10.1038/srep10833

在一項(xiàng)新研究中，麻省理工學(xué)院的研究人員利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，對受到HBV感染的哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯，從中刪除了乙肝病毒（HBV）DNA。他們靶向切割了HBV病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）中的一些特異性位點(diǎn)。

在這項(xiàng)研究中，Vyas Ramanan和同事們設(shè)計(jì)了24條單向?qū)NA（sgRNA）來靶向從在線病毒序列信息資源庫中鑒別出的一些HBV基因組位點(diǎn)。經(jīng)過初篩測試后，研究小組將三種最有效的sgRNA和Cas9蛋白插入到慢病毒載體中，然后將它們轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)將HBV DNA整合到宿主基因組的人類肝細(xì)胞內(nèi)。

通過利用包含整合性HBV基因組DNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系展開實(shí)驗(yàn)，研究人員觀察到HBV總DNA和cccDNA逐漸減少，在36天時(shí)cccDNA下降了92%。他們還觀察到HBV病毒基因表達(dá)和復(fù)制水平顯著減少。

如今，Ramanan計(jì)劃在人類肝臟嵌合小鼠模型中測試這一方法，以評估和優(yōu)化傳遞方法和給藥方法，及更好地了解需要除去多少的cccDNA才能到達(dá)人類功能性的治愈。

2. Mol Ther Nucleic Acids：利用CRISPR/Cas9抑制HBV感染
Molecular Therapy Nucleic Acids, 2014 December; 3(12): e216, doi:10.1038/mtna.2014.68

在一項(xiàng)新的研究中，為了研究源自傳染性HBV的cccDNA是否能夠被直接靶向摧毀，來自美國福克斯蔡斯癌癥中心（Fox Chase Cancer Cente）的研究人員在表達(dá)HBV受體---鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP）---的人HepG2中使用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)。他們測試了不同的HIV特異性的向?qū)NA（gRNA），并證實(shí)它們能夠高達(dá)8倍地抑制HBV感染。這種抑制是HBV cccDNA發(fā)生突變和缺失---類似于Cas9切割染色體DNA和隨后基于NHEJ介導(dǎo)的DNA修復(fù)時(shí)觀察到的情形---所導(dǎo)致的。α干擾素（IFN-α）并不對CRISPR/Cas9系統(tǒng)的抗病毒活性產(chǎn)生可衡量的影響，這提示著Cas9和NHEJ活性并不受這種細(xì)胞因子（即IFN-α）誘導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)的影響。

3. Mol Ther：利用CRISPR/Cas9讓HBV cccDNA功能性滅活
Molecular Therapy, online publication 21 June 2016; doi: 10.1038/mt.2016.94

在一項(xiàng)新的研究中，通過采用下一代測序（NGS）技術(shù)，來自美國福克斯蔡斯癌癥中心（Fox Chase Cancer Cente）的Christoph Seeger、Ji A Sohn和同事們確定了在Cas9切割和基于非同源末端連接（NHEJ）的修復(fù)后，HBV cccDNA所發(fā)生的完整突變譜。他們發(fā)現(xiàn)，90%以上的乙肝病毒DNA都能被Cas9切割。此外，研究結(jié)果還表明，在Cas9切割后對HBV DNA進(jìn)行基因編輯的效率是在對被HBV感染的細(xì)胞進(jìn)行α干擾素（IFN-α）處理后發(fā)生的APOBEC蛋白介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基作用的1500倍以上。研究還發(fā)現(xiàn)，以前用來檢測DNA胞嘧啶脫氨基作用的3D-PCR方法方法高估了發(fā)生基因編輯的HBV DNA的數(shù)量和頻率。

總之，研究人員證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)是迄今為止在功能上讓HBV cccDNA失活和提供一種慢性乙肝治愈療法的最好途徑。

4. Gene Ther：我國科學(xué)家利用CRISPR破壞乙肝病毒
Gene Therapy, 2015, 22, 404–412; doi:10.1038/gt.2015.2; published online 5 February 2015

2015年2月5日，來自我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)院研究所、第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院、日本京都大學(xué)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院等處的研究人員，在Nature旗下Gene Therapy期刊上發(fā)表一項(xiàng)最新的研究成果，題為“Harnessing the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated Cas9 system to disrupt the hepatitis B virus”。

在這項(xiàng)研究中，研究人員研究靶向乙肝表面抗原（HBsAg）編碼區(qū)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞中和活的小鼠體內(nèi)的效果。結(jié)果表明，CRISPR/Cas9可在體內(nèi)和體外抑制HBV復(fù)制和表達(dá)，可能是治療HBV感染的一種新策略。

5. Mol Ther Nucleic Acids：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體內(nèi)促進(jìn)肝內(nèi)HBV模板清除
Molecular Therapy Nucleic Acids, 2014, 3, e186; doi:10.1038/mtna.2014.38

在當(dāng)前的抗病毒治療下，HBV cccDNA持續(xù)存在是根治慢性乙肝的一大障礙。治愈慢性乙肝需要新的策略來特異性地破壞HBV cccDNA。為了研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)是否能夠切割HBV基因組，來自中國國立臺(tái)灣大學(xué)的研究人員設(shè)計(jì)出8種針對A基因型HBV的gRNA。

利用這些HBV特異性的gRNA，CRISPR/Cas9系統(tǒng)顯著性地降低感染上HBV表達(dá)載體的Huh7細(xì)胞中的乙肝核心抗原（HBcAg）和乙肝表面抗原（HBsAg）產(chǎn)生。在這8種篩選出的gRNA中，他們鑒定出兩種有效的gRNA。有趣的是，其中的一種靶向保守性HBV序列的gRNA在不同基因型的HBV中都能發(fā)揮作用。

利用一種流體動(dòng)力學(xué)-HBV持續(xù)存在小鼠模型，研究人員進(jìn)一步證實(shí)這種CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠切割肝內(nèi)含有HBV基因組的質(zhì)粒，促進(jìn)它在體內(nèi)被清除，從而導(dǎo)致血液中的HBsAg水平下降。

這些數(shù)據(jù)提示著CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在體外和體內(nèi)破壞HBV表達(dá)模板，并且表明它有潛力根除持續(xù)性HBV感染。

6. Virus Res：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)抗HBV效應(yīng)
Virus Research, Volume 217, 2 June 2016, Pages 125–132, doi:10.1016/j.virusres.2016.04.003

在一項(xiàng)新的研究中，來自中國同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向剔除HBV基因組中的保守性區(qū)域。通過讓核酸內(nèi)切酶Cas9攜帶HBV S基因和X基因的同源序列，他們構(gòu)建出pCas9。通過利用pCas9開展實(shí)驗(yàn)，他們證實(shí)pCas9-2能夠更好抵抗HBV產(chǎn)生，而且在Huh7和HepG2細(xì)胞之間沒有顯著差異。

在M-TgHBV的HBV感染小鼠模型中，注射pCas9會(huì)降低血液中的HBsAg水平和肝臟中的HBcAg水平。

總之，這種人工構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)抗HBV效應(yīng)，而且有潛力作為一種新的療法治療慢性HBV感染。

7. Sci Rep：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)破壞HBV S基因和X基因保守性序列
Scientific Reports, 2015 Sep 3;5:13734. doi: 10.1038/srep13734

為了在治療上應(yīng)用于人體，人工設(shè)計(jì)出的核酸內(nèi)切酶Cas9應(yīng)當(dāng)能夠識(shí)別不同基因型的HBV，同時(shí)產(chǎn)生最小的脫靶效應(yīng)。

針對此，在一項(xiàng)新的研究中，德國研究人員鑒定出HBV基因組的S區(qū)域和X區(qū)域在不同基因型中都保守的HBV序列，而且能夠利用一種Cas9酶特異性地和高 效地靶向切割這些保守性序列。這一方法不僅破壞報(bào)告細(xì)胞系中的游離HBV cccDNA和HBV在染色體上的整合靶位點(diǎn)，而且也破壞慢性感染和新感染的肝癌細(xì)胞系中的HBV復(fù)制。

這些數(shù)據(jù)提示著將CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為旨在治愈HBV感染的新策略具有可行性。

8. World J Gastroenterol：利用雙gRNA指導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)高效地抑制HBV復(fù)制
World Journal of Gastroenterology, 2015 Aug 28; 21(32):9554-65, doi:10.3748/wjg.v21.i32.9554

為了篩選和研究有效地抵抗A、B、C和D基因型HBV的gRNA，來自中國北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部的研究人員總共設(shè)計(jì)出15種gRNA（分別記為gRNA-1，gRNA-2，…，gRNA-15）。他們從中選擇了11種靶向HBV基因組調(diào)節(jié)區(qū)域的雙gRNA組合。他們研究了每種gRNA和這11種雙RNA組合抑制A、B、C和D基因型HBV復(fù)制的效率。

研究人員證實(shí)所有的gRNA能夠顯著地抑制體外細(xì)胞培養(yǎng)物中的HBsAg或HBeAg產(chǎn)生，所有雙RNA組合能夠高效地抑制A、B、C和D基因型HBV中的HBsAg或HBeAg產(chǎn)生，而且當(dāng)與單個(gè)gRNA相比時(shí)，雙RNA組合抑制HBsAg或HBeAg產(chǎn)生的效率顯著增加。

再者，通過利用PCR直接測序，研究人員證實(shí)這些雙gRNA組合能夠通過移除這兩種使用的gRNA的切割位點(diǎn)之間的序列片段，特異性地破壞HBV表達(dá)模板。最為重要的是，gRNA-5和gRNA-12的雙gRNA組合不僅能夠高效地抑制HBsAg和/或HBeAg產(chǎn)生，而且也破壞HepAD38細(xì)胞中的HBV cccDNA池。

這些結(jié)果提示著CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠高效地破壞HBV表達(dá)模板（A、B、C和D基因型HBV），而且沒有明顯的細(xì)胞毒性。

9. J Gen Virol：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)抑制不同基因型HBV復(fù)制
Journal of General Virology, 2015 Aug;96(8):2252-61, doi:10.1099/vir.0.000159

為了研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)是否可能破壞HBV DNA模板，來自中國武漢大學(xué)的研究人員設(shè)計(jì)出8種靶向不同基因型HBV的保守區(qū)域的gRNA，而且這些gRNA能夠在體外和體內(nèi)顯著地抑制HBV復(fù)制。

再者，這種HBV特異性的gRNA/Cas9系統(tǒng)能夠抑制不同基因型HBV在細(xì)胞中的復(fù)制，而且利用單個(gè)gRNA/Cas9系統(tǒng)能夠顯著降低HBV DNA，而且利用不同的gRNA/Cas9系統(tǒng)組合能夠清除HBV DNA。

10. Antiviral Res：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)高效抑制HBV復(fù)制
Antiviral Research, Volume 118, June 2015, Pages 110–117, doi:10.1016/j.antiviral.2015.03.015

作為一種新的基因組編輯工具，CRISPR/ Cas9系統(tǒng)能夠被用來準(zhǔn)確地和高效地改造和修飾基因組DNA。

在一項(xiàng)新的研究中，來自中國蘇州大學(xué)的研究人員合成出4種靶向HBV基因組保守區(qū)域的單向?qū)NA（sgRNA）。在Huh7細(xì)胞和HBV復(fù)制性細(xì)胞HepG2.2.15中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)降低HBV產(chǎn)生。他們進(jìn)一步證實(shí)CRISPR/Cas9的直接切割和這種切割介導(dǎo)的突變發(fā)生于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的HBV cccDNA中。

在攜帶HBV cccDNA的小鼠模型中，通過快速地尾靜脈注射含sgRNA-Cas9的質(zhì)粒導(dǎo)致較低水平的HBV cccDNA和HBV蛋白產(chǎn)生。

總之，這種CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確地和高效地靶向HBV cccDNA和抑制HBV復(fù)制。它有可能被用來治療慢性HBV感染。

11. Virology：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)抑制HBV DNA積累
Virology, Volume 476, February 2015, Pages 196–205, doi:10.1016/j.virol.2014.12.001

在一項(xiàng)新的研究中，來自美國杜克大學(xué)和埃默里大學(xué)的研究人員通過對細(xì)菌Cas9基因和單向?qū)NA（sgRNA）進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，觀察到在體外的HBV慢性感染和新感染的模型中，HBV DNA產(chǎn)生受到高效抑制。HBV特異性的Cas9/sgRNA組合降低總HBV DNA水平高達(dá)1000倍左右和降低HBV cccDNA水平高達(dá)10倍左右，而且也通過突變讓殘留的絕大多數(shù)HBV DNA失活。

總之，這些數(shù)據(jù)提供概念驗(yàn)證表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)有潛力有效地剔除慢性HBV感染者體內(nèi)的HBV cccDNA池。