microRNA和piRNA研究

來源：作者：人氣：-發表時間：2014-07-09 14:43:00【大中小】

microRNA和piRNA研究

AGO蛋白家族

AGO蛋白家族是指與以小分子RNA(small RNA)為介質的遺傳基因發現控制機構有關的蛋白質群。基于氨基酸序列的相似性，AGO蛋白家族又分為AGO亞族與PIWI亞族，已發現在生殖細胞、干細胞（ES、iPS等）中有表達。

和光純藥公司推出了眾多用于對miRNA和mRNA（存在于細胞和組織中的RISC的組成成分）進行功能分析的工具，這些工具不僅適用于對miRNA的分析，同時也適用于對靶標mRNA的分析。

	AGO蛋白家族
	AGO亞族	PIWI亞族
人	AGO1, AGO2, AGO3, AGO4	PIWIL1 / HIWI, PIWIL2 / HILI, PIWIL3, PIWIL4 / HIWI2
鼠	AGO1, AGO2, AGO3, AGO4	PIWIL1 / MIWI, PIWIL2 / MILI, PIWIL4 / MIWI2
RNA結合蛋白	microRNA、siRNA等	piRNA等

1. microRNA研究
 （1）microRNA純化試劑盒系列：
（2）cDNA編碼microRNA試劑盒的制備
 （3）抗體
2. piRNA研究

【產品信息】

1. microRNA研究

microRNA（簡稱miRNA）是一種長約22個nt（核苷酸）的內源性RNA分子，通過與靶標mRNA的互補配對，可抑制mRNA的裂解和翻譯，從而在動植物體內發揮重要的調控作用。據推測，在人體和鼠體內存在上千種miRNA，因此對于miRNA的各種研究（例如對功能不明的新型miRNA的鑒定以及對與特定疾病相關的miRNA功能的說明等）迅速發展成為一大研究領域。近來，血清中存在miRNA這一重大事實的發現，開創了利用miRNA作為生物標志物進行包括癌癥在內的疾病治療的醫學未來。一般認為，microRNA發揮作用的方式如下：先在細胞中經過多個階段發育成熟，再與蛋白質結合生成蛋白質復合物“RISC”（“RNA誘導沉默復合物”），然后與RISC主要組成部分AGO亞族蛋白結合，后再與靶標mRNA結合，從而達到降解mRNA鏈或抑制翻譯的目的。

人體中存在4種AGO亞族蛋白（hAgo1～hAgo4），可泛表達基因信息，但表達水平因類型而異。在AGO亞族蛋白中，只有AGO2具備對靶標RNA 裂解的切割酶活性，因此是一種具表達水平的蛋白質，可在miRNA合成途徑中發揮至關重要的作用。由于RISC能夠與AGO蛋白抗體發生免疫沉淀，因此可從RISC沉淀物中回收miRNA；而且進一步研究表明，靶標miRNA為共沉淀劑，因此免疫沉淀成法為研究miRNA功能的基本方法。

鑒于上述情況，和光純藥特別推出了眾多對miRNA功能進行分析的工具，其中主要為利用抗AGO抗體的miRNA研究工具。通過組合使用上述工具，即可實現對miRNA和mRNA（存在于細胞和組織中的RISC的組成成分）的綜合分析— miRNA分析和靶標mRNA分析。

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（1） microRNA純化試劑盒系列：

一種基于利用AGO蛋白抗體的免疫沉淀方法

特性：

1）適用于內源性AGO蛋白的免疫沉淀法
2）miRNA與AGO蛋白結合的純化性能高
3）其他RNA（如rRNA（核糖體）和RNA的降解片段）的污染度低
4）適用于microRNA的高效克隆以及純化microRNA成分的微陣列技術（測定基因表達譜的方法和技術）

microRNA提取試劑盒，人/鼠AGO1（10次反應；產品編號：291-70201）
microRNA提取試劑盒，人AGO2（10次反應；產品編號：292-66701）
microRNA提取試劑盒，鼠AGO2（10次反應；產品編號：292-67301）
microRNA提取試劑盒，人AGO3（10次反應；產品編號：297-70301）

如果您對上述產品感興趣，請致電400-021-8158了解更多詳細情況!

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（2）cDNA編碼microRNA試劑盒的制備

和光純藥microRNA克隆試劑盒可以用于制備cDNA編碼microRNA，只需在microRNA片段制備后的1.5日之內即可完成克隆過程。該試劑盒中含有從蝦中提取的堿性磷酸酶（SAP），能與其中的耐熱性單鏈DNA連接酶（另售）和原改良接頭發生連接反應。與傳統方法（利用從細菌中提取的堿性磷酸酶和T4 RNA連接酶）相比，克隆效率顯著提高。

特點：

1）耐熱性連接酶能夠實現接頭的準確連接，從而提高克隆效率
2）適用于microRNA克隆以形成二級結構
3）操作簡單，只需在1.5日之內即可生成cDNA編碼microRNA

和光microRNA克隆試劑盒（8次反應；產品編號：290-66501）

接頭連接高效、準確、簡捷

耐熱性單鏈DNA連接酶重組體解決方案（200個單位（產品編號：298-65103）；500個單位（產品編號：292-65101）

和光靶標mRNA克隆試劑盒（10次反應；產品編號：298-68001）

和光純藥生產的靶標mRNA克隆試劑盒用于借助微量mRNA實現cDNA擴增，尤其是利用AGO IP RNA片段實現microRNA靶標mRNA克隆。擴增后的cDNA將成為microRNA的靶標mRNA。

特點：

1）方法簡易
2）具備實現微量mRNA擴增的性能
3）cDNA擴增方式不依賴于mRNA的長度
4）適用于microRNA靶標mRNA的研究

和光PCR純化試劑盒（30次反應（產品編號：298-67901）

和光純藥生產的PCR純化試劑盒，用于在利用RT-PCR或PCR完成DNA合成后的僅10分鐘內去除在各種分子生物學試驗反應緩沖液中形成的引物、引物二聚體、dNTP（三磷酸脫氧核苷酸）以及諸如DNA聚合酶、限制性內切酶等多種酶。

THUNDER Taq Gold DNA聚合酶（不含鎂離子的緩沖液） （250個單位；產品編號：317-07081），PCR（聚合酶鏈式反應）用耐熱性DNA聚合酶

建議采用THUNDER Taq Gold DNA聚合酶（不含鎂離子的緩沖液）來抑制非特異性擴增。THUNDER Taq Gold DNA聚合酶用于PCR的熱啟動，在進入PCR循環前，在95℃的溫度下經過10分鐘的熱處理后被活化。由于利用THUNDER Taq Gold DNA聚合酶（不含鎂離子的緩沖液）方式實現擴增后的DNA片段是一種腺嘌呤的3'末端，因此能夠直接插入到T載體中。

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（3）抗體

AGO1抗體、單克隆抗體（1F2）
（50μL（產品編號：018-22401））〈用于蛋白質印跡法〉
AGO1抗體、單克隆抗體（2A7）
（50μL（產品編號：015-22411））〈用于免疫沉淀法〉
抗人AGO2抗體、單克隆抗體（4G8）
（50μL（產品編號：011-22033）；100μL（產品編號：015-22031）
〈用于蛋白質印跡法、免疫沉淀法以及免疫細胞化學染色法〉
抗小鼠AGO2抗體、單克隆抗體（2D4）
（50μL（產品編號：014-22023）；100μL（產品編號：018-22021）
〈用于蛋白質印跡法、免疫沉淀法以及免疫細胞化學染色法〉
抗人AGO3抗體、單克隆抗體（1C12）
（50μL（產品編號：018-23241））〈用于免疫沉淀法〉

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2. piRNA研究

PIWIL1抗體、單克隆抗體（2C12）
(100 μL （產品編號：017-23451））〈用于免疫沉淀法〉

特點：

1) 可免疫沉淀內在性PIWIL1蛋白質。（5～10µg濃度為10%的蛋白G微珠）
2) 可免疫沉淀PIWI1結合piRNA。
3) 可在人、鼠的組織和細胞中使用。

使用例：

(1) 小鼠精巢中內源性PIWIL1的免疫沉淀（IP)-1

Lane 1: NEC14 cells, mouse IgG IP分級 (1/2 vol.)
Lane 2: NEC14 cells, 2C12 IP分級 (1/2 vol.)
Lane 3：小鼠精巢 IgG IP分級 (1/2 vol.)
Lane 4：小鼠精巢, 2C12 IP分級 (1/2 vol.)

Cell number: 1 x 107 cells
組織（小鼠精巢）重量 25mg
第一抗體（蛋白質印跡）
Anti PIWIL1 polyclonal antibody
(gifted from Dr. Miyagawa, Osaka Univ.)
This antibody is not available from Wako.

(2) 小鼠精巢中內源性PIWIL1的免疫沉淀（IP)-2

Lane M：分子量Marker
Lane 1：小鼠IgG IP分級 (1/2 vol.)
Lane 2: 2C12 IP分級 (1/2 vol.)
組織（小鼠精巢）重量 25mg
第一抗體（蛋白質印跡）
Anti PIWIL1 polyclonal antibody
(gifted from Dr. Miyagawa, Osaka Univ.)
This antibody is not available from Wako.

(3) PIWIL1結合piRNA的精制