Nature：抗體正在誤導(dǎo)科學(xué)界

來源：生物谷作者：人氣：-發(fā)表時(shí)間：2016-01-07 08:45:00【大中小】

一大堆利用抗體標(biāo)記神經(jīng)遞質(zhì)（受體）的論文來襲，抗體正在誤導(dǎo)科學(xué)界

1994年到2011年間，《比較神經(jīng)學(xué)》（Comparative Neurology）期刊的主編Clifford Saper經(jīng)常看到一大堆利用抗體標(biāo)記神經(jīng)遞質(zhì)及其受體位置的論文。2000年前后，基因敲除小鼠在生物領(lǐng)域大受歡迎，但結(jié)果令人不安。這提醒了Clifford Saper一個(gè)事實(shí)：抗體正在誤導(dǎo)科學(xué)界。

Clifford Saper先生現(xiàn)在是波士頓貝絲·以色列·迪肯尼斯醫(yī)療中心（Beth Israel Deaconess Medical Center,BIDMC）神經(jīng)部門主席，根據(jù)他的回憶：理論上，基因敲除動(dòng)物的染色結(jié)果應(yīng)該和對(duì)照組小鼠的染色結(jié)果存在很大差別；但那時(shí)候他收到的論文中很多照片結(jié)果幾近相同，于是乎越來越多的論文被撤稿。不過Saper團(tuán)隊(duì)也意識(shí)到，他們?nèi)狈ο到y(tǒng)的方法來評(píng)估這些使用抗體的論文。

為此，Saper領(lǐng)銜了其所在的期刊進(jìn)行革命并提出了要求作者提供論文中使用的抗體的廣泛驗(yàn)證數(shù)據(jù)的原則。Saper在接受Nature采訪時(shí)表示：盡管這條對(duì)文章的嚴(yán)謹(jǐn)性有很大好處，但對(duì)于論文的投稿與約稿不利，很多作者會(huì)覺得麻煩而選擇投稿到其它雜志。但雜志社的堅(jiān)持和努力最終形成了JCN抗體數(shù)據(jù)庫——一個(gè)包含幾千個(gè)可信賴的神經(jīng)解剖學(xué)抗體的database。

處于困境的抗體市場(chǎng)：多抗、多抗、重組抗體孰優(yōu)孰劣？

如今，科研者仍然不斷遭遇抗體的悲劇。最常見的是：購買的用于檢測(cè)蛋白X的抗體優(yōu)先與蛋白Y結(jié)合（甚至可能完全不與X結(jié)合）；可重復(fù)性差，用新抗體重復(fù)以前的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果無法重復(fù)。一個(gè)好項(xiàng)目因此擱淺，抗體的不可靠性問題非常讓人警醒。

同一個(gè)抗體在幾次平行實(shí)驗(yàn)里得出的結(jié)果不同，將會(huì)產(chǎn)生災(zāi)難性的結(jié)果，而導(dǎo)致這一結(jié)果卻可能與抗體的生產(chǎn)過程有關(guān)。特異性不足、敏感度和批次差異性等導(dǎo)致了錯(cuò)誤的科研發(fā)現(xiàn)和大量的科研精力浪費(fèi)；抗體的不可靠性造成了癌癥、代謝、老化、免疫學(xué)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及任何研究復(fù)雜的生物分子的領(lǐng)域的巨大損失；因抗體而造成的、在時(shí)間和資源方面的浪費(fèi)非常巨大。

多克隆抗體是通過收集經(jīng)過目標(biāo)抗原刺激動(dòng)物獲得免疫后的血液而制成的（只要這只動(dòng)物還活著，就能夠一直提供多克隆抗體）；單克隆抗體是通過宿主動(dòng)物接受目標(biāo)蛋白免疫，然后提取出能識(shí)別并對(duì)該抗原發(fā)生響應(yīng)的B細(xì)胞，使其與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，從而成為可永久培養(yǎng)的細(xì)胞，從而不斷產(chǎn)生目的抗體。

相比之下，重組抗體不同于傳統(tǒng)的單克隆抗體，因?yàn)樗鼈兊闹苽洳恍枰獎(jiǎng)游铩Ｏ喾矗ㄟ^檢測(cè)產(chǎn)生該抗體的基因序列（通過對(duì)動(dòng)物的免疫細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序、或自己設(shè)定序列，檢測(cè)產(chǎn)生的蛋白是否符合目標(biāo)蛋白）；再將該基因插入到合適的細(xì)胞株中，從而產(chǎn)生抗體。由于抗體是確定的，即使原始細(xì)胞株死亡或發(fā)生突變，也能通過基因插入，產(chǎn)生需要的細(xì)胞株。

位于蒙哥馬利已有40多年銷售多克隆抗體的經(jīng)歷的Bethyl Laboratories的首席科學(xué)官Eric McIntush表示：學(xué)界對(duì)重組抗體也會(huì)有需求，他們不可能把資金投入到可能永遠(yuǎn)不賣的產(chǎn)品中，因此公司計(jì)劃從2016年起銷售重組抗體。盡管多克隆抗體具有廣泛可用性，是目前研發(fā)最便宜的抗體，適用于制備一些研究較少的抗體。但隨著目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的不斷明確，以及臨床轉(zhuǎn)化的需求，重組克隆抗體也將大有可為。

瑞士蘇黎世大學(xué)（University of Zurich）蛋白質(zhì)工程學(xué)家Andreas Plückthu等人也認(rèn)為，單克隆抗體和多克隆抗體最終會(huì)被“結(jié)構(gòu)更明確”的重組抗體完全取代。他表示，許多蛋白質(zhì)不能被現(xiàn)有的試劑識(shí)別，這是因?yàn)槭褂昧私Y(jié)構(gòu)不明確的多克隆抗體，因此他建議為什么不使用一些基因可識(shí)別或存儲(chǔ)的試劑呢？

出于對(duì)抗體質(zhì)量的追求，由2007年發(fā)起的Protein Capture Regeants和2010年發(fā)起的Affinomics兩個(gè)公共基金資助的項(xiàng)目主要致力于檢測(cè)市面上銷售的抗體和蛋白結(jié)合試劑的質(zhì)量。目前這兩個(gè)項(xiàng)目都已接近尾聲。結(jié)果顯示：某些抗體尤其是轉(zhuǎn)錄因子的抗體質(zhì)量格外參差不齊，這些試劑領(lǐng)域的后續(xù)投資會(huì)取得較高的回報(bào)率。

技術(shù)的進(jìn)步和科學(xué)界的需求或?qū)⒔K結(jié)抗體亂象泥潭

抗體是生命科學(xué)領(lǐng)域最常用的工具之一，經(jīng)常在 Western blot中揭示細(xì)胞或組織樣本中特定蛋白質(zhì)的表達(dá)量的多少。此外，抗體也被用于免疫組化和免疫熒光染色，以便于在顯微鏡下可視化地觀察蛋白，以及其它各類基于抗體會(huì)與特定生物分子結(jié)合的實(shí)驗(yàn)。

數(shù)以百計(jì)的抗體供應(yīng)商讓人眼花繚亂

根據(jù)網(wǎng)上生物試劑商城Biocompare 2015年發(fā)表的一份報(bào)告：2015年科研用抗體市場(chǎng)規(guī)模達(dá)到25億美金且該數(shù)據(jù)仍在增長(zhǎng)。由于多克隆抗體能以多種方式靶向目標(biāo)分子，不僅容易制造，而且在不同背景下都能特異性地識(shí)別目標(biāo)蛋白，因此市場(chǎng)份額較大。一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2006年以來10000篇生物醫(yī)學(xué)論文引用了1293種多克隆抗體、755種單抗隆抗體和1種重組單克隆抗體。

據(jù)估計(jì)，每年因購買質(zhì)量差的抗體導(dǎo)致的損失達(dá)到8億美金，更不要說所造成的無數(shù)的錯(cuò)誤結(jié)論、不可解釋的（或曲解）實(shí)驗(yàn)，以及浪費(fèi)了的病人樣本和增加了的徒勞的研究時(shí)間。瑞典皇家理工學(xué)院的研究員Mathias Uhlén表示，因抗體而造成的挫敗已經(jīng)太多了，是時(shí)候做出改進(jìn)了，科學(xué)界對(duì)解決這個(gè)問題懷有很大興趣。

對(duì)抗體的不滿意激勵(lì)了各領(lǐng)域人士采取行動(dòng)

2015年9月，Uhlén主持了由人類蛋白質(zhì)組組織舉辦的抗體驗(yàn)證工作組成立大會(huì)。同月，美國(guó)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)主辦的圓桌會(huì)議也探討了抗體問題，預(yù)計(jì)明年年初發(fā)布抗體選擇建議， NIH也參與了這次會(huì)議。從今年1月起，美國(guó)的基金分配將包含驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所需的抗體和其它關(guān)鍵資源質(zhì)量的項(xiàng)目。只有這樣，基金申請(qǐng)人和基金評(píng)委在描述如何認(rèn)證材料時(shí)才將有據(jù)可依。

抗體驗(yàn)證工作組成立大會(huì)提出了一系列粗略的抗體重要標(biāo)準(zhǔn)草稿、評(píng)價(jià)體系以及驗(yàn)證方法：包括利用包括基因敲降（knockdown）和基因敲除來驗(yàn)證在目標(biāo)蛋白缺乏的情況下，抗體是否仍會(huì)發(fā)生結(jié)合的方法；也包括把靶蛋白帶上熒光標(biāo)簽、驗(yàn)證抗體是否會(huì)與未標(biāo)記的蛋白發(fā)生結(jié)合的手段；包括把新抗體和質(zhì)量好的抗體進(jìn)行比較；包括通過質(zhì)譜儀來檢測(cè)分析抗體能與哪些分子結(jié)合；標(biāo)準(zhǔn)草稿將重點(diǎn)關(guān)注在特定實(shí)驗(yàn)、特定上下文中抗體的效果。

經(jīng)過特殊設(shè)計(jì)，只有當(dāng)兩種抗體都結(jié)合于同一蛋白分子時(shí)，才會(huì)發(fā)出信號(hào)（紅色）

CRISPR–Cas9等新技術(shù)有助于抗體質(zhì)量的驗(yàn)證，擁有抗體驗(yàn)證數(shù)據(jù)成公司優(yōu)勢(shì)

抗體公司開始把有抗體驗(yàn)證的數(shù)據(jù)看成是一大競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)：一些抗體供應(yīng)商發(fā)布了自己的驗(yàn)證結(jié)果，新的技術(shù)也將有助于抗體質(zhì)量的驗(yàn)證。

英國(guó)的生命科學(xué)試劑供應(yīng)商Abcam的首席執(zhí)行官Alan Hirzel表示，為了驗(yàn)證出售的抗體的質(zhì)量，其公司使用了可以精細(xì)調(diào)整DNA的CRISPR–Cas9基因組編輯方法；并計(jì)劃在各種目標(biāo)基因經(jīng)CRISPR–Cas9技術(shù)切除的人類細(xì)胞系中驗(yàn)證抗體，然后把每個(gè)抗體的驗(yàn)證結(jié)果發(fā)布出來。

賽默飛世爾的首席科學(xué)官Klaus Lindpaintner表示：公司已經(jīng)擁有能夠驗(yàn)證抗體質(zhì)量的技術(shù)，雖然在5-10年前他們根本沒辦法做到這點(diǎn)；

2015年6月，伯樂公司發(fā)布了一系列經(jīng)過12種不同細(xì)胞系裂解物Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗體；

2014年，抗體公司Proteintech利用小干擾RNA敲除基因的表達(dá)，然后驗(yàn)證每一個(gè)新抗體產(chǎn)品的信號(hào)是否隨著蛋白表達(dá)的下降而下降。

NIH的抗體鑒定項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)室主任Gordon Whiteley表示，抗體鑒定項(xiàng)目的目的是鑒別癌癥生物學(xué)可靠的抗體清單，上述這些努力仍然不夠，只有極小一部分公司愿意展開驗(yàn)證工作，并不是所有的公司都披露具體的測(cè)試條件，或何種情況下抗體的表現(xiàn)不佳，因此寫明測(cè)試條件和測(cè)試結(jié)果同樣重要。

抗體生產(chǎn)商Cell Signaling Technology公司的CSO Roberto Polakiewicz表示，檢測(cè)抗體并沒有最佳方法，開發(fā)抗體是一種科學(xué)試驗(yàn)，需要有專業(yè)的人士來驗(yàn)證抗體。倘若客戶不能基于驗(yàn)證結(jié)果做出選擇，他們會(huì)傾向于尋找一種新的抗體，且抗體在一個(gè)特定實(shí)驗(yàn)或特定樣本中的表現(xiàn)良好，并不意味著它在其它實(shí)驗(yàn)里也能表現(xiàn)良好。

著眼現(xiàn)在：成立抗體驗(yàn)證平臺(tái)收集重要信息

供應(yīng)商要求使用者寫試用心得、用戶體驗(yàn)

加州大學(xué)的信息科學(xué)家、資源識(shí)別倡議項(xiàng)目（Resource Identification Initiative，RII）組長(zhǎng)Anita Bandrowski指出：從其他研究者的論文中得到信息是最高效的方法；但問題是只有不到一半的實(shí)驗(yàn)論文具體描述了試劑使用的抗體貨號(hào)；即使作者們寫明了抗體貨號(hào)，公司可能會(huì)停止出售該產(chǎn)品。RII倡議建立一個(gè)有助于獨(dú)特的抗體識(shí)別體系，并說服幾十種雜志要求作者明確地寫明使用的抗體。

三種抗體（綠色）靶向同一線粒體蛋白質(zhì)，右圖顯示了重組抗體與其他蛋白結(jié)合

目前已有十幾個(gè)專門幫助研究人員選擇抗體的網(wǎng)站，這些網(wǎng)站收集用戶對(duì)抗體性能的評(píng)價(jià)，并提供比較工具：科學(xué)出版社F1000旗下網(wǎng)站Antibody Validation Channel，允許研究人員把自己在抗體購買網(wǎng)站上的賬戶貼出來，甚至還能請(qǐng)同行針對(duì)抗體結(jié)果給出意見和建議；Biocompare雇了一個(gè)內(nèi)容編輯，專門聯(lián)系研究者們，請(qǐng)他們對(duì)抗體寫評(píng)價(jià)。

一些抗體供應(yīng)商，如St John's Laboratory，為研究人員提供使用產(chǎn)品，要求使用者寫試用心得；，抗體網(wǎng)上銷售平臺(tái)Antibodies-online安排了一個(gè)獨(dú)立的、第三方機(jī)構(gòu)對(duì)抗體進(jìn)行驗(yàn)證；Antibodypedia網(wǎng)站的基因敲減計(jì)劃于2016年9月推出，研究者屆時(shí)可以通過抗體驗(yàn)證掙到幾百美金：免費(fèi)試用抗體，通過小干擾序列或CRISPR–Cas9等基因沉默技術(shù)來驗(yàn)證抗體的信號(hào)強(qiáng)度隨著蛋白表達(dá)的下降而下降，然后把數(shù)據(jù)提交到網(wǎng)站，就可以獲得網(wǎng)站獎(jiǎng)勵(lì)的幾百美金。

展望未來：利用程序來評(píng)估抗體質(zhì)量，提供抗體性能的定量信息

只有供應(yīng)商開始提供抗體的驗(yàn)證數(shù)據(jù)，抗體質(zhì)量才會(huì)有保障

國(guó)際結(jié)構(gòu)基因組學(xué)聯(lián)盟（Structural Genomics Consortium, SGC）主任、多倫多大學(xué)Aled Edwards教授和同事們使用質(zhì)譜檢測(cè)和比較1000多種抗體免疫沉淀的蛋白質(zhì)，參考5個(gè)實(shí)驗(yàn)室、歷時(shí)4年，花費(fèi)了3百萬美元（不含各種人士的好心捐贈(zèng)）建立了一個(gè)程序來評(píng)估抗體質(zhì)量和提供抗體性能的定量信息，尤其是蛋白沉降實(shí)驗(yàn)，即使用抗體將溶液中的目標(biāo)蛋白沉淀下來。

挪威奧斯陸大學(xué)國(guó)家醫(yī)院的蛋白組學(xué)專家Fridtjof Lund-Johansen正在開發(fā)一個(gè)高效的、可同時(shí)檢測(cè)幾千種抗體的磁珠試驗(yàn)法，或?qū)⒓?xì)胞蛋白分離成許多不同的組分，然后用兩種不同的方法對(duì)每個(gè)組分中的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析：一種是質(zhì)譜法（質(zhì)譜數(shù)據(jù)作為參照，用于檢測(cè)芯片結(jié)果）；另一種是基于磁珠陣列、攜帶幾千種抗體的芯片。

瑞典烏普薩拉大學(xué)的蛋白組學(xué)技術(shù)開發(fā)商Ulf Landegren表示，對(duì)抗體的全面評(píng)估可能被過分解讀，他認(rèn)為一種抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合的能力遠(yuǎn)比討論抗體是否能與正確的蛋白質(zhì)以及其它分子結(jié)合有意義。當(dāng)抗體結(jié)合非目標(biāo)蛋白以外的蛋白時(shí)，有可能發(fā)生了交叉反應(yīng)。由于與兩種抗體都發(fā)生結(jié)合的分子不太可能代表非目標(biāo)蛋白，研究人員與其僅僅依賴一個(gè)抗體，不如成對(duì)地檢測(cè)能與同一目標(biāo)蛋白不同部分結(jié)合的抗體。

然而，科學(xué)家們很難知道他們購買的抗體到底與哪個(gè)部分結(jié)合。供應(yīng)商往往從不同來源獲取產(chǎn)品，并且不需要披露原始制造商。正如Salk Institute的神經(jīng)科學(xué)家Paul Sawchenko提醒的那樣，供應(yīng)商不能保證一個(gè)給定的抗體對(duì)每種組織樣本都有效。除非碰巧有人在和你一樣的樣本、一樣的實(shí)驗(yàn)條件下驗(yàn)證過該抗體的特異性，否則你需要自己去驗(yàn)證這個(gè)抗體到底有沒有效。

綜上所述，抗體市場(chǎng)監(jiān)管不足，產(chǎn)品質(zhì)量沒有保障。只有當(dāng)研究者們投入精力到抗體的選擇上，供應(yīng)商才會(huì)開始提供抗體的驗(yàn)證數(shù)據(jù)，抗體質(zhì)量才有保障。