PEG修飾劑在蛋白質和肽類藥物中的應用

來源：作者：人氣：-發表時間：2023-07-05 09:25:00【大中小】

PEG可以與藥物共價結合形成復合物，用于控制藥物的釋放，延長藥物的半衰期，降低免疫原性和抗原性，降低毒性，增強藥物靶向性，減少劑量和給藥頻率。PEGylation可以改善許多藥物的藥動學和藥效學性質。

蛋白質類藥物主要包括細胞因子、酶、抗體、激素等一些具有特殊功能的蛋白質。由于天然或重組的未經修飾的蛋白質類藥物具有半衰期短、有一定的免疫原性、溶解度低、毒副作用大、易被蛋白酶降解等缺點，從而減弱了其臨床效果。

目前，用于預防、治療和診斷疾病的多肽類藥物主要包括多肽疫苗、抗腫瘤多肽、抗病毒多肽、多肽導向藥物、細胞因子模擬肽、抗菌性活性肽、診斷用多肽以及其他藥用小肽等。

修飾機理

PEG修飾蛋白質和肽類藥物可以延長藥物的半衰期、降低免疫原性，同時盡量保留其生物活性。其機理為：蛋白質經過PEG化學修飾之后，修飾劑與蛋白質分子偶聯，使得蛋白質的分子量增大，空間結構發生改變。PEG在被清除前不會被降解，PEG的屏障作用保護了蛋白質不易被蛋白酶降解，同時減少了抗體的產生，當修飾后的蛋白質分子量達到或超出腎小球濾過作用的閔值時，蛋白質隨血液循環進入腎臟后就可以逃避腎小球濾過作用，因而可以在血液循環中停留更長的時間。

主要修飾位點

在構成蛋白質的20種常見氨基酸中，只有具有極性的氨基酸殘基的側鏈基團才能夠進行PEG修飾。其親核活性通常按下列順序依次遞減：巰基>α-氨基>?-氨基>羧基>羥基。常用的氨基酸是蛋白質序列中的半胱氨酸、賴氨酸以及氮末端和碳末端氮基酸。

PEG和蛋白質或多肽之間的反應主要為酰化反應、烷基化反應、氧化還原反應、芳香環取代反應等，對蛋白、肽類藥物修飾途徑主要有氨基修飾（包括N端氨基的酰化修飾、賴氨酸側鏈氨基的酰化修飾、N端氨基的烷基化修飾）、羧基修飾、巰基修飾，還有其它如控制pH選擇性修飾蛋白質側鏈基團、金屬離子或酶催化、糖蛋白中糖基定點修飾等。

1）氨基修飾

氨基修飾常用修飾劑為PEG-SS、PEG-SC、PEG-SPA、PEG-NHS、PEG-BTC、PEG-CHO、PEG-ALD、PEG-tresylate和PEG-epoxide等。

人類白細胞抗原（Human leucocyte antigen, HLA）是保持個體穩定的一組糖蛋白，在移植免疫中起著重要作用。為了研究mPEG 有效修飾HLA 抗原，阻斷HLA 抗原與其相應抗體間特異性免疫反應的方法。隨機挑選41例無償血清10ml，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，用HEPES/RPMI-1640 洗滌3次，調細胞濃度至每毫升2×105左右。在22℃，pH 7.4的PBS介質中，采用濃度梯度法用mPEG-BTC（MW 5kD）修飾淋巴細胞表面HLA-I類抗原。結果顯示經mPEG-BTC取代后的淋巴細胞表面HLA-I類抗原與其相應抗體間的微量淋巴細胞毒試驗為陰性。也就是經mPEG修飾后可以完全阻斷HLA- I類抗原與其相應抗體間的特異性免疫反應[1]。

將奧曲肽與SPA-mPEG（MW 2000）或ALD-mPEG（MW 2000/5000）進行化學改性，通過生物活性檢測發現，SPA-mPEG修飾的奧曲肽顯示出較低的活性，而ALD-mPEG定點修飾在奧曲肽的N末端，生物活性沒有降低且ALD-mPEG 5K能顯著改善藥代動力學特性[2]。

2）巰基修飾

蛋白質中和多肽中只有半胱氨酸含有巰基，利用巰基的高親核性，可以選取能定向修飾蛋白質和多肽的PEG修飾劑。相對沒有半胱氨酸的蛋白質，可以通過基因工程手段或是Traut’s試劑（2-亞氨氫氯化硫醇）處理蛋白引入巰基反應位點。常用修飾劑為PEG-Mal、PEG-OPSS、PEG-VS、PEG-IA、PEG-DAQ和PEG-Se等。

人睫狀神經營養因子(human ciliary neuronotrophic factor,hCNTF)在中樞神經系統中可以促進神經干細胞的增殖，抑制其向膠質細胞的分化，具有保護受損神經元的功能。采用mPEG-MAL（MW 40kDa），對重組人睫狀神經營養因子突變體CNTF-C17的第17位半胱氨酸巰基進行定點修飾。實驗結果表明，在pH 8.0的Tris-HCl緩沖液體中，蛋白質與修飾劑的比例為1:3，4℃下反應12h，修飾率可達到90%以上，通過陰離子交換層析可獲得純度95%以上的單修飾產物。通過藥代動力學考察，體內循環半衰期相對原蛋白顯著提高了30.3倍[3]。

3）羧基修飾

羧基修飾位點包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。首先需將羧基活化，即先將PEG中的羧基轉化為氨基，再在DCCI或EDC存在下與蛋白質的羧基結合，常用的修飾劑為PEG-HZ或PEG-NH2[4]。

單鏈聚乙二醇只有末端可用于修飾新型偶聯藥物，因此載藥量較低。后續不斷開發出支鏈聚乙二醇，支鏈結構在一個或多個端上具有官能團，如末端呈樹枝結構的支鏈PEG、叉狀PEG和多臂PEG等，從而實現多種共軛可能性，且大大增加了載藥量。

PEG修飾劑列表

貨號	品名	描述
ECS4133A	mPEG-NHS, MW 350	mPEG-Succinimidyl ester
AJL0190A	mPEG-SC, MW 1K
ACS0112B	mPEG-SC, MW 2K
ECS4382A	mPEG-SC, MW 3.4K
AJL0190B	mPEG-SC, MW 5K
ACS0115B	mPEG-SC, MW 10K
ECS4219A	mPEG-SPA, MW 1K	mPEG-Succinimidyl Propionate
ECS4356A	mPEG-SPA, MW 2K
ECS4275A	mPEG-SPA, MW 5K
ECS4094A	mPEG-SPA, MW 20K
ECS4284A	mPEG-SS, MW 5K	mPEG-Succinimidyl Succinate ester
ECS2001A	mPEG-SCM, MW 20K	mPEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
ECS2103A	mPEG-SCM, MW 40K	mPEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
ECS4171A	mPEG-SG, MW 2K	mPEG-Succinimidyl Glutarate ester
ECS4334A	mPEG-SVA, MW 5K	mPEG-Succinimidyl valerate
ECS4154A	mPEG-Mal, MW 350	mPEG-Maleimide
ECS4155A	mPEG-Mal, MW 500
ECS4156A	mPEG-Mal, MW 1K
DCS0133A	mPEG-Mal, MW 2K
ECS4168A	mPEG-Mal, MW 4K
ACS0135B	mPEG-Mal, MW 5K
ACS0136A	mPEG-Mal, MW 10K
ACS0137A	mPEG-Mal, MW 20K
ECS4150A	mPEG-ALD, MW 1K	mPEG-Aldehyde
ECS4194A	mPEG-CHO, MW 2K
ACS0121A	mPEG-CHO, MW 5K
ECS4212A	mPEG-EPO, MW 550	mPEG-Epoxide
ECS4198A	mPEG-EPO, MW 2K
ECS4182A	mPEG-EPO, MW 10K
ECS4317A	mPEG-HZ, MW 350	mPEG-Hydrazide
ECS4278A	mPEG-HZ, MW 2K	mPEG-Hydrazide
ECS4157A	mPEG-NH2, MW 350	mPEG-Amine
ECS4244A	mPEG-NH2, MW 550
ECS2165A	mPEG-NH2, MW 1K
ACS0105B	mPEG-NH2, MW 2K
ACS0106B	mPEG-NH2, MW 3.4K
ECS4296A	mPEG-NH2, MW 4K
ACS0107B	mPEG-NH2, MW 5K
ECS2180A	mPEG-NH2, MW 10K
ACS0109B	mPEG-NH2, MW 20K
ECS2069C	Mal-PEG-SCM, MW 2K	Maleimide-PEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
ECS2069B	Mal-PEG-SCM, MW 5K
ECS2069A	Mal-PEG-SCM, MW 10K
ECS4208A	Mal-PEG-NHS, MW 200	Maleimide-PEG-NHS
ACS1695B	Mal-PEG-NHS, MW 2K
ECS2072A	Mal-PEG-NHS, MW 3.4K
ECS2065A	Mal-PEG-NHS, MW 5K
ECS4137A	MAL-PEG-SVA, MW 5K	Maleimide-PEG-Succinimidyl valerate
ECS4192A	Mal-PEG-HZ, MW 2K	Maleimide-PEG-Hydrazide
ECS2005A	NHS-PEG-SH,MW 200	Thiol-PEG- Succinimidyl ester
ECS2006A	NHS-PEG-SH,MW 400
ECS2007A	NHS-PEG-SH,MW 500
ECS2017A	SH-PEG-NHS, MW 600
ECS2009A	NHS-PEG-SH,MW 800
ECS2010A	NHS-PEG-SH,MW 1K
ECS4307A	SH-PEG-NHS, MW 2K
ECS4407A	SH-PEG-NHS, MW 5K
ECS4205A	SH-PEG-NH2, MW 600	Thiol-PEG-Amine
ECS4095A	SH-PEG-NH2, MW 2K
ECS1978B	SH-PEG-NH2, MW 3.4K
DCS2049A	SH-PEG-NH2, MW 5K
ECS4142A	SH-PEG-NH2, MW 10K
ECS2096A	SH-PEG-COOH, MW 400	Thiol-PEG-Acid
ECS4245A	SH-PEG-COOH, MW 1K
ECS1991B	SH-PEG-COOH, MW 2K
ECS2021A	SH-PEG-COOH, MW 3.4K
ECS2118A	SH-PEG-COOH, MW 5K
ECS2182A	SH-PEG-CHO, MW 5K	Thiol-PEG- Aldehyde
ECS4174A	SH-PEG-SH, MW 400	Thiol-PEG-Thiol
ECS4173A	SH-PEG-SH, MW 600
ECS2084A	SH-PEG-SH, MW 2K
ECS4143A	SH-PEG-HZ, MW 10K	Thiol-PEG-Hydrazide
ECS4383A	SH-PEG-Biotin, MW 200	Thiol-PEG-Biotin
ECS4412A	SH-PEG-Biotin, MW 5K	Thiol-PEG-Biotin
ECS4292A	SC-PEG-SC, MW 400	Succinimidyl ester-PEG-Succinimidyl ester
ECS2117B	SC-PEG-SC, MW 2K
ECS4233A	SC-PEG-SC, MW 3.4K
ECS4264A	SC-PEG-SC, MW 5K
ECS4311A	SC-PEG-SC, MW 10K
ECS4255A	NHS-PEG-COOH, MW 3.4K	NHS-PEG-Acid
ECS2071A	NHS-PEG-VS, MW 3.4K	NHS-PEG-Vinylsulfone
ECS4135A	NHS-PEG-OH, MW 2K	NHS-PEG-Hydroxy
ECS4354A	SS-PEG-SS, MW 2K	Succinimidyl Succinate ester-PEG-Succinimidyl Succinate ester
ECS4172A	SG-PEG-SG, MW 2K	Succinimidyl Glutarate ester-PEG-Succinimidyl Glutarate ester
ECS4231A	SG-PEG-SG, MW 3.4K
ECS2129A	SPA-PEG-SPA, MW 3.4K	Succinimidyl Propionate-PEG-Succinimidyl Propionate
ECS4290A	SCM-PEG-SCM, MW 2K	Succinimidyl Carboxymethyl Ester-PEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
ECS4195A	SCM-PEG-SCM, MW 5K
ECS4291A	SCM-PEG-SCM, MW 20K
ECS4298A	OPSS-PEG-NHS, MW 5K	Ortho-Pyridyldisulfide-PEG-NHS
ECS4082A	OPSS-PEG-SCM, MW 5K	Ortho-Pyridyldisulfide-PEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
ECS4199A	AC-PEG-SC, MW 2K	Acrylate-PEG-NHS
ECS2051A	AC -PEG-SVA, MW 3.4K	Acrylate-PEG-Succinimidyl valerate
ECS2098A	AC-PEG-SCM, MW 2K	Acrylate-PEG-SCM
ECS4247A	Biotin-PEG-SCM, MW 600	Biotin-PEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
ECS4343A	Biotin-PEG-SC, MW 2K	Biotin-PEG- Succinimidyl ester
EYD0528B	Biotin-PEG-SC, MW 5K	Biotin-PEG- Succinimidyl ester
ECS4248A	Biotin-PEG-SS, MW 600	Biotin-PEG-Succinimidyl Succinate ester
ECS4249A	Biotin-PEG-SG, MW 600	Biotin-PEG-Succinimidyl Glutarate ester
ECS4246A	Biotin-PEG-SVA, MW 600	Biotin-PEG-Succinimidyl valerate
ECS4162A	CHO-PEG-OH, MW 2K	Aldehyde-PEG-Hydroxy
ECS2174A	CHO-PEG-CHO, MW 2K	Aldehyde-PEG-Aldehyde

相關文獻

[1]李偉, 張印則, 周華友, 蘭炯采, 章揚培, 張志欣. mPEG 修飾HLA 抗原的方法學研究. 生命科學研究, 2003, 7(4): 374-376.

[2] Dong Hee Na, Kang Choon Lee, Patrick P DeLuca. PEGylation of octreotide: II. Effect of N-terminal mono-PEGylation on biological activity and pharmacokinetics. Pharm Res, 2005, 22(5): 743-9.

[3]馮翠, 王祺, 張純, 秦培勇, 鄭秀玉, 王健, 劉永東, 蘇志國. PEG定點修飾重組人睫狀神經營養因子及其生物活性評價. 中國生物工程雜志, 2015, 35(5): 15-21.

[4] Kynclova E, Elsner E, K?pf A, et al. Novel method for coupling of poly(ethyleneglycol) to carboxylic acid moieties of proteins. Journal of Molecular Recognition, 1996, 9(5-6):644-651.