PNAS：重大進展！制定出利用CRISPR/Cas9高效編輯基因組規(guī)則
CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前發(fā)現(xiàn)存在于大多數(shù)細菌與所有古生菌中的一種免疫系統(tǒng)，被用來識別和摧毀入侵的噬菌體和其他的病原體。在這種系統(tǒng)中，CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的簡稱。在過去5年里，CRISPR/Cas9作為一種有效切割DNA的工具在科學(xué)界廣受歡迎。它經(jīng)改造后用于哺乳動物細胞中。本質(zhì)上，這種工具是一套精簡的分子“剪刀”。
科學(xué)家們普遍認為，細胞通過隨機地插入一組核苷酸來修復(fù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)的DNA斷裂。這通常會破壞任何位于發(fā)生斷裂的DNA位點處的基因。
科學(xué)家們已知細胞有時利用供者DNA來修復(fù)細胞基因組中的斷裂。然而，這種供者DNA序列本身不會自我插入到細胞基因組中的空白位點上。相反，這種供者DNA的每個末端都存在著一種同源臂（homology arm）以便封閉這種切割造成的空隙。
這些同源臂由與遺傳密碼匹配的DNA的完整部分重疊的核苷酸組成。這有助這種供者DNA“粘附到”完整的DNA上。
然而，鑒于供者DNA需要比較長的同源臂（特別是當插入較長的DNA序列、單鏈DNA或環(huán)狀DNA時，而且也很難制備出較長的單鏈DNA和環(huán)狀DNA），科學(xué)家們認為利用供者DNA修復(fù)DNA斷裂是一種低效的方法。隨著科學(xué)家們在CRISPR方面積累了更多的經(jīng)驗，關(guān)于供者DNA的最佳設(shè)計規(guī)則和供者DNA的同源臂長度的問題就出現(xiàn)了。
為了解答這些問題，在一項新的研究中，來自美國約翰霍普金斯大學(xué)的研究人員將不同的供者DNA組合插入到人胚胎腎細胞中，這些細胞以其生長良好的能力和經(jīng)常用于癌癥研究中而為人所知。他們使用攜帶著編碼一種綠色熒光蛋白的基因的供者DNA，當這種基因成功地插入到細胞基因組中時，這種綠色熒光蛋白就會在細胞的核膜上發(fā)出綠色熒光。相關(guān)研究結(jié)果于2017年11月27日在線發(fā)表在PNAS期刊上，論文標題為“Precision genome editing using synthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks”。
綠色熒光蛋白基因的供者DNA成功地插入到細胞基因組
圖片來自Alexandre Paix
約翰霍普金斯大學(xué)助理研究員Alexandre Paix發(fā)現(xiàn)線性DNA片段非常適合作為供者DNA，而且它們在人細胞中編輯DNA的效率比環(huán)狀DNA（這里指質(zhì)粒）高2～5倍。Paix說，“線性DNA在實驗室中很容易通過PCR擴增法加以制備。”
Paix也測試了不同長度的同源臂。他發(fā)現(xiàn)最佳的同源臂長度大約為35個核苷酸（35nt），比科學(xué)家們通常使用的要短得多。
具體而言，這些研究人員發(fā)現(xiàn)長度為33～38nt的同源臂與長度為518nt的同源臂具有相同的編輯成功率，在最佳條件下產(chǎn)生10％～20％的編輯成功率。相反之下，當他們利用長度為15～16nt的同源臂進行測試時，這種基因插入成功率下降了一半。他們在人基因組的三個不同的位點上重復(fù)了這些結(jié)果。他們還發(fā)現(xiàn)新插入的DNA序列能夠長達1000nt（不包括同源臂）。
這些研究人員利用長度為57～993nt的供者DNA序列取得的編輯成功率在10%～50%。更短的供者DNA要比更長的供者DNA取得更高的編輯成功率。比如，長57nt的供者DNA、長714nt的供者DNA和長993nt的供者DNA插入到細胞基因組靶位點上的成功率分別為45.5%、23.5%和17.9%。當長度超過1000nt時，長1122nt的供者DNA和長2229nt的供者DNA具有非常低的插入成功率---大約為0.5%。
約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究副主任Geraldine Seydoux博士說，“在序列長度比較大時，導(dǎo)入編輯所需的供者DNA數(shù)量是非常困難的。細胞往往會因具有這么多的DNA而窒息。”
最后，這些研究人員還發(fā)現(xiàn)當供者DNA距離CRISPR/Cas9切割位點不到30nt時，編輯成功率達到最高。Seydoux說，“當這種距離超過30nt時，這種插入是不可行的。”
Seydoux補充道，“這些參數(shù)應(yīng)當能夠適用于科學(xué)家們試圖編輯的大多數(shù)基因。事實上，大多數(shù)實驗涉及對距離CRISPR切割位點僅兩到三個核苷酸的位置進行編輯。”
這些研究人員也測試了這種方法是否能夠在小鼠胚胎中發(fā)揮作用。通過使用具有長36nt的同源臂的PCR擴增片段，他們在87種小鼠胚胎中，成功地將一種長739nt的DNA序列（編碼一種綠色熒光蛋白）插入到27種小鼠胚胎中。
這些研究人員已正在利用這些修復(fù)規(guī)則來研究秀麗隱桿線蟲中的DNA，而且他們正在研究這些修復(fù)規(guī)則是否也適用于其他類型的人細胞。
Seydoux說，在這些修復(fù)規(guī)則被廣泛采用之前，它們應(yīng)當在更多的人細胞類型和其他的有機體中接受測試。
文章來源
Alexandre Paix, Andrew Folkmann, Daniel H. Goldman et al. Precision genome editing using synthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks. PNAS, Published online: 27 Nov 2017, doi:10.1073/pnas.1711979114
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