深度解析，自身免疫疾病藥物探索進展

來源：生物谷作者：人氣：-發表時間：2015-03-09 08:48:00【大中小】

吡啉相關周期熱綜合征（CAPS）是一類嚴重的自身免疫性疾病，它的病因是調控先天免疫反應的重要原件-炎癥小體-一個蛋白質成分NLRP3發生了獲得性病變。不僅如此，NLRP3的突變對于2型糖尿病、多發性硬化，阿茲海默癥，痛風，動脈粥樣硬化等復雜的疾病也有負面的影響。

大約在十年之前，NLRP3炎癥小體作為一類先天免疫系統中的重要調節元件被科學家們鑒定出來。這個蛋白質復合體由NOD Like Receptor家族蛋白NLRP3，接口蛋白ASC以及caspase1三類蛋白組成，主要在髓系淋巴細胞中發揮功能。NLRP3炎癥小體能夠被一系列不同的外刺激激活，包括細菌穿孔素以及細胞壞死產生的毒性物質（例如MHGB1）。NLRP3首先受到感應，之后與其它兩類蛋白質發生聚合，最終切割proIL-1 beta形成成熟的，有功能的炎性因子IL-1 beta進而分泌到胞外。后續的大量研究發現NLRP3炎癥小體還能夠被一些非感染性刺激激活，例如ATP，固態晶體顆粒（二氧化硅，尿酸鹽等），從而為一些IL-1 beta介導的自身免疫病的發病機理提供了重要線索。

目前針對炎癥小體開發的藥物主要集中在下游細胞因子IL-Ibeta上面。其中包括重組人IL-1受體拮抗劑anakinra，IL-1 beta中和性抗體kanakinumab（2012年諾華上市藥物），可溶性IL-1受體誘捕劑rilonacept（Regeneron公司08年上市藥物）。另外一些小分子可以起到抑制抑制NLRP3活性的作用，比如優降糖（格列苯脲）可以特異性抑制NLRP3炎癥小體導致的IL-1beta的產生。然而這些藥物大多特異性不高，不僅針對NLRP3炎癥小體，還對其他一些因素引起的炎癥反應具有普遍的抑制作用。因此，開發特異性抑制NLRP3的相關藥物是治療CAPS等由NLRP3突變導致的自身免疫病的最佳選擇。

雙芳基磺酰基類化合物抑制NLRP3炎癥小體的激活

早在2001年就有研究發現一系列雙芳基磺酰基類化合物可以起到抑制IL-1 beta的切割成熟的作用。最近愛爾蘭都柏林圣三一學院生化與免疫學院Luke A J O'Neill課題組在《nature medicine》發表了他們對于其中一種化合物MCC950的詳細研究。

首先，他們利用LPS與ATP聯合刺激小鼠骨髓巨噬細胞誘導IL-1 beta的產生（經典的炎癥小體激活途徑）與TNF-alpha產生（經典的NF-kappaB途徑），在此基礎上加入MCC950觀察刺激結果。結果顯示：發現MCC950能夠抑制IL-1beta的產生，但對TNF-alpha的產生并沒有影響。之后他們用鉀離子通道激活劑nigericin代替ATP（兩者都是NLRP3炎癥小體的激活劑）進行刺激，結果與之前相似。以上結果暗示了MCC950抑制NLRP3激活的效應。

之后，作者向小鼠巨噬細胞感染鼠傷寒沙門氏菌（一種可以激活NLRC4炎癥小體的病菌），并在此基礎上加入MCC950觀察抑制效果。結果顯示：即使在非常高的濃度下，MCC950依然不能抑制IL-1beta與TNF-alpha的激活。同樣，作者也證明了MCC950并不能抑制由poly（dA：dT）引起的AIM2炎癥小體的激活，以及LPS引起的NF-kappaB的激活。以上實驗充分說明了MCC950抑制效應的特異性。

之前的研究告訴我們：NLRP3激活之后會與ASC以及caspase1結合形成蛋白復合體，也就是我們之前所說的"炎癥小體"，之后ASC會依賴NLRP3形成同源多聚體。作者通過生化實驗發現：MCC950能夠抑制細胞激活之后成熟的IL-1 beta以及caspase1的形成與分泌，但并不能影響pro-IL-1 beta與pro-caspase1的產生。之后，作者發現MCC950能夠減弱炎癥小體激活之后ASC的多聚化。

由于K離子的外流是普遍的NLRP3的激活方式，作者希望研究是否MCC950抑制了鉀離子的流動。然而實驗結果顯示，雖然MCC950具有明顯的抑制效果，它并不能抑制外界刺激導致的K離子的外流，說明MCC950作用在K離子外流的下游。另外，作者也證明了MCC950也不影響鈣離子的流動。由于之前的實驗中作者觀察到了MCC950能夠抑制ASC的多聚化，作者希望了解MCC950能否抑制NLRP3-NLRP3以及NLRP3-ASC之間的相互作用。然而實驗結果顯示：MCC950對此均沒有影響。

之前的研究表明向小鼠腹腔注射LPS能夠引起NLRP3依賴性的炎癥反應。作者利用這一體內模型證明MCC950具有明顯的抑制NLRP3炎癥反應的作用。另外，作者利用EAE小鼠（一類模擬人類多發性硬化自身免疫疾病的小鼠模型）也同樣得到了這一結論。

最后，作者利用CAPS的小鼠模型WMS（NLRP3發生獲得型突變）進行體內實驗，結果顯示MCC950能夠抑制WMS小鼠的血清中IL-18的水平，并且能夠明顯提高小鼠的體重與壽命。

Beta-羥基丁酸抑制NLRP3炎癥小體的激活

酮體類物質（例如Beta-羥基丁酸BHB，乙酰乙酸AcAc）是脂肪代謝的中間產物，在缺乏充足能量時，它們作為備用的ATP來源能夠起到維持哺乳動物生命的作用。節食，高強度運動，補充低碳生酮類食物等方式能夠提高胞內酮體類物質的含量。而且有研究發現較長時間的禁食能夠降低炎癥反應強度，然而這其中的原因并不清楚。耶魯大學醫學院免疫系的Vishwa Deep Dixit課題組同時發表在本期《nature medicine》上的一項研究揭示了beta-羥基丁酸抑制NLRP3激活的作用。

首先，作者利用LPS與ATP對小鼠骨髓巨噬細胞進行刺激誘導NLRP3的激活，同時向其中加入不同的酮體類物質。結果顯示：beta-羥基丁酸能有明顯抑制以上刺激引起的IL-1beta與caspase1的成熟，然而它的兩個同類物質：乙酰乙酸與丁酸則沒有這種效應。隨后作者試驗了其它幾種不同的NLRP3激活劑（尿酸鹽晶體，二氧化硅晶體，nigericin以及幾種脂類物質等），結果顯示BHB均能抑制這幾種物質引起的caspase1的切割成熟。另外，BHB并不能抑制Francisel latularensis引起的AIM2炎癥小體的激活或者由Salmonellatyphimurium引起的的NLRC4炎癥小體的激活。

由于長期禁食引起的循環系統中BHB的增多能夠引起氧化應激反應，AMPK活性提升以及自噬效應等，而且這些效應都被認為可能與炎癥小體的調節有關。而后續的突變分析發現：氧化應激效應的障礙或者自噬作用的障礙都不能影響BHB抑制NLRP3活性的效應，人為地提高AMPK的活性不能重現BHB抑制NLRP3的表型，AMPK活性的障礙也不能影響BHB原有的功能。另外。實驗結果也顯示BHB的功能不依賴于G蛋白偶聯受體GPR109a。以上實驗結果表明BHB在抑制NLRP3激活方面的功能與之前報道過的其它功能彼此獨立。

另外，作者希望了解BHB的這一功能是否與自身的代謝過程（氧化，進入TCA循環，降低線粒體電勢等）有關。但是突變分析的實驗結果顯示與這些都沒有關系。意外的是，作者發現BHB能夠明顯抑制刺激條件下胞內鉀離子的外流，而且能夠抑制炎癥小體蛋白之間的聚合。

最后，作者進行了體內實驗，發現BHB能夠有效抑制NLRP3介導的炎癥反應，而且有趣的是，在人為注射BHB之外，給小鼠的日常飲食調配生酮類食物也能夠達到相似的效果。

以上兩篇研究雖然沒有清楚地得到抑制NLRP3的分子機制，然而這兩篇研究開拓了我們對于NLRP3炎癥小體抑制藥物的研發視野。更加有意思的是，如果我們能夠通過進食達到藥物治療的目的，那么將會大幅降低自身免疫病患者的治療痛苦。這也是我們應該努力的方向。


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