· 榮膺Nature Methods雜志年度方法

· 無需抗體、直接檢測樣品中蛋白質的含量

· 高特異性：同時分析蛋白上數個肽段

· 高靈敏度：可檢測低至amol級（10^-18）的蛋白信號

· 高通量: 可同時分析數十個蛋白質含量

蛋白質是生命活動的直接執行者，生物學研究離不開分析蛋白質的組成及含量變化。目前研究樣本中蛋白質的含量都是間接方法：

1.基于抗體的檢測方法，如Western blotting、ELISA。這些方法的可靠性、靈敏度非常依賴于抗體的質量。對那些沒有商業化的抗體的蛋白而言，無法用這些方法分析蛋白含量變化。

2.通過基因表達的變化預測蛋白質含量變化，但是mRNA和蛋白含量之間相關性并并不強，導致結果經常出現偏差。

那么，有沒有一種方法無需通過抗體、或者轉錄水平這些間接的方法，而是能夠之間分析樣品中的含量呢？答案是肯定的, 這種方法就是我們要介紹的蛋白質組技術。按照實驗目的可以將蛋白質組技術分為兩大類：高通量蛋白質組學和靶向蛋白質組學，分別用于前期的差異蛋白篩選以及后續的目標蛋白驗證。例如針對臨床Biomarker的篩選，通常是首先應從有限數目的臨床樣本中使用高通量的方法篩選出差異的目標蛋白，然后使用靶向蛋白組技術針對目標蛋白進行擴大樣本的驗證，如下圖1：

高通量蛋白質組和靶向蛋白質組分別有各自不同的技術體系，以下對其主要的技術方法和特點做一個簡要介紹：

1.高通量蛋白質組，主要使用的DDA（Data Dependent Acquisition）技術體系。DDA是基于鳥槍法（shotgun）的原理，因為生物樣品中蛋白質復雜程度極高，儀器不可能做到全部信號的采集，因此只能在每一個檢測循環中優先采集相對較強的信號。這種方法有兩個局限性：第一，對于低強度的信號無法有效采集，限制了檢測的靈敏度；第二，檢測中“較高的信號”是一個相對的概念，不同樣品甚至不同批次的上機不可避免地產生一定的隨機性。

2.靶向蛋白質組技術，顧名思義是只選取和檢測目標蛋白相關的信號，忽略其他無關的信號，因此可以實現對目標蛋白定量的高特異性和高準確性。如果我們將常用的高通量蛋白質組技術方法理解為霰彈槍，那么靶向蛋白質組技術就是狙擊槍（圖2）。

靶向蛋白質組技術主要包括SRM/MRM和PRM兩種方法。SRM/MRM （Selected/ Multiple reaction monitoring）使用的是三重四級桿的質譜，利用四級桿高選擇性的特點對母離子和子離子依次進行分選，該技術在2012年的在Nature Methods中有詳細的總結論述¹，并被評為年度技術（Method of the Year 2012），可見其重要意義和應用價值。在SRM/MRM的基礎上，2012年晚些時候，在MCP上報道了新型的靶向蛋白組技術——PRM（Parallel reaction monitoring）技術²，該技術結合了四級桿的高選擇性以及Orbitrap的高分辨、高精度特性，能夠對二級圖譜進行獨立的鑒定，方法流程更加便捷（圖3）。與傳統的SRM/MRM相比，PRM在復雜背景下具有更優秀的抗干擾能力和檢測靈敏度（圖4）。因此，PRM是更具優勢和潛力的新型靶向蛋白質組檢測方法，堪稱SRM/MRM的升級版。

PRM相比WB方法的優勢

以上我們介紹了靶向蛋白質組的技術原理和特點。那么，靶向蛋白質組技術和傳統的基于免疫的方法（WB、ELISA）相比有什么優勢呢？我們將二者的比較總結為以下的表格：

PRM應用舉例

PRM因為具有精確的鑒定和定量能力，現在已經廣泛應用與生命科學研究中，以下是一些例子：

1，普渡大學的研究者在PNAS上發表了通過血液外泌體尋找癌癥相關biomarkers的研究。研究人員高通量蛋白質組技術尋找出差異蛋白的磷酸化位點，然后使用了PRM的方法進行擴大樣本的驗證³，如下圖5，可以看出的確這四個潛在的biomarker在病人和健康人群體中有顯著的分布差異。

2，在植物研究領域中，常常因為缺乏商業化的抗體而阻礙了研究的深入。而PRM技術的出現無疑是植物科研工作者的福音。2014年JPR上的一篇報道使用了PRM的方法來研究植物信號調節過程中的蛋白質降解的現象⁴，如下圖6，可以看到針對FLS2的兩條unique peptide的PRM定量結果是非常一致的，這表明針對這個蛋白的定量結果高度可信。

實驗流程

靶向蛋白質組PRM的檢測服務，結合高通量蛋白質組和修飾組檢測技術，能夠給大家的科研提供更全面的服務與支持。PRM檢測的基本流程包括：

在可行性評估階段，依據現有數據和文獻報道等進行預先的評估，有效的評估是后續實驗成功的重要保障。之后，通過實驗和分析進行相應的方法學建立，然后開展正式的PRM檢測。
  
參考文獻：
1 Picotti, P. & Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods 9, 555 (2012).
2 Amelia C. Peterson, et al. Reaction Monitoring for High Resolution and High Mass Accuracy Quantitative, Targeted Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics Mcp 11, 1475 (2012).
3 Chen, I. H. et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 114, 3175 (2017).
4 Petra, M. et al. Targeted proteomics analysis of protein degradation in plant signaling on an LTQ-Orbitrap mass spectrometer. Journal of proteome research 13, 4246 (2014).