糖的分析方法

來源：作者：人氣：-發表時間：2015-10-08 15:17:00【大中小】

糖具有重要的生物學功能：(1) 提供能量。植物的淀粉和動物的糖原都是能量的儲存形式。 (2) 物質代謝的碳骨架，為蛋白質、核酸、脂類的合成提供碳骨架。 (3) 細胞的骨架。纖維素、半纖維素、木質素是植物細胞壁的主要成分，肽聚糖是原核生物細胞壁的主要成分。 (4) 細胞間識別和生物分子間的識別。細胞膜表面糖蛋白的寡糖鏈參與細胞間的識別。一些細胞的細胞膜表面含有糖分子或寡糖鏈，構成細胞的天線，參與細胞通信。紅細胞表面ABO血型決定簇就含有巖藻糖。在糖化學的研究中，需要用到各種糖類，Elicityl提供各種糖，有葡聚糖、黃膠原、木聚糖、低聚果糖(DP6/GF5)、纖維聚糖混合物(DP2-DP9)等多種糖類，用于科研分析、化妝品原料等。

一、中性糖的測定

1．還原糖的次亞碘酸鹽定量法

適用：各種醛糖；適用于測定淀粉酶解時糖苷鍵水解的百分率，也可測定淀粉酶產物的寡聚糖鏈長。

基本反應：

CH2OH(CHOH)nCHO+I2+3NaOH → CH2OH(CHOH)nCOONa+2NaI+2H2O (氧化)

I2+2Na2S2O3 → Na2S4O6+ NaI (滴定)

2．3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法

原理：在堿性溶液中，3,5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色氨基化合物，在一定范圍內還原糖的量與反應液的顏色強度呈比例關系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。

注意：該法不是化學計量反應，戊糖、已糖和雙糖與DNS反應的生色度A500/μmol糖的值分別是：戊糖（木糖、阿拉伯糖）：0.42；已糖（葡萄糖、半乳糖、甘露糖）：0.46；雙糖（麥芽糖、乳糖）：0.65。

有人認為還原糖的醛基被氧化為羧基，但當量不準確，不同的糖類產生不等等量的色度，表明它的化學反應是較復雜的。

3．Somogyi-Nelson法

還原糖將銅試劑還原成氧化亞銅，在濃硫酸存在下與砷鉬酸生成藍色溶液，在560nm下的光密度與還原糖濃度呈比例關系。

注意：比方法重復性較好，產物穩定，測定范圍10-180μg/mL。

4．苯酚-硫酸法

苯酚-硫酸試劑可與游離的或寡糖、多糖中的已糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起顯色反應，已糖在490nm處，戊糖及糖醛酸在480nm處有較大吸收，吸收值與糖含量呈線性關系。

注意：

（1）該法顏色持久，較穩定；

（2）每種糖的顯色值不同，故不宜直接用于雜多糖的定量測定；分析雜多糖時，可根據各種單糖的組成比及主要組分單糖的標準曲線的校正系數加以校正計算。

（3）有顏色的樣品，測定值偏高；

（4）此法較適于檢測凝膠柱部分收集樣品中相對糖量的分析。

5．蒽酮-硫酸法

糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛或其衍生物，可與蒽酮試劑縮合產生顏色物質，反應后溶液呈藍綠色，于620nm處有較大吸收，顯色與多糖含量呈線性關系。

注意：該法可用于多糖、單糖含量測定。色氨酸含量較高的蛋白質對顯色反應有一定干擾。

6．地衣酚-硫酸法

糖經濃無機酸處理脫水產生糠醛或糠醛衍生物，生成物能與酚類化合物縮合成有色物質。

注意：

（1）該方法操作較簡便，廣泛用于測定糖蛋白中總糖含量；

（2）該方法的缺點是氨基糖存在時，可導致顏色降低，大量的色氨酸存在也可導致一些誤差，但對中性糖的測定結果是可靠的。

（3）各種單糖的顯色值不同，故用于雜多糖的定量測定時要注意。

7．戊糖的測定（地衣酚法）

戊糖與氯化高鐵鹽酸溶液或硫酸鐵銨鹽酸溶液一起加熱，與地衣酚試劑反應，形成藍綠色溶液，用比色法定量測定戊糖含量。

注意：此法可用于測定五碳糖，方法簡單，但缺點是靈敏度較低，且因蛋白質、雜糖等干擾不易測準確。

8．已糖和6-脫氧已糖的比色測定

糖蛋白和蛋白聚糖（糖胺聚糖）中的已糖和6-去氧已糖可分別采用苯酚-硫酸法和半胱氨酸-硫酸法進行比色定量。若代之以苯酚-半胱氨酸-硫酸反應，則既可用于含上述兩類糖基之一的勻多糖或雜多糖的組成測定量，也可以一次呈色，同時測定糖蛋白樣品中兩種糖基的含量。

注意：

（1）適用于一種樣品的兩種已糖的同時測定。

（2）當應用本法于兩類糖基的同時測定時，共存糖基間可能發生干擾。比如，高巖藻糖含量不影響半乳糖的測定，而半乳糖含量高時，會使巖藻糖含量偏高。

9．葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖

原理：

葡萄糖氧化酶

β-D-葡萄糖+H2O+O2 → D-葡萄糖酸+ H2O2

H2O2+還原性染料（無色） → 氧化型染料（有色）

注意：

（1）葡萄糖氧化酶試劑適合現用現配，放置冰箱暗處可保存半個月。

（2）由于葡萄糖氧化酶液中同時混雜有麥芽糖酶和其它葡萄糖苷酶，如果達到專一測定糖化酶活力的目的，用Tris-甘油緩沖液，因為緩沖液中的兩種成分都有抑制麥芽糖酶和其它葡萄糖苷酶的能力。

10．高效液相色譜法

由于糖類在紫外線外光、可見光、熒光下均無特征吸收，故糖類直接采用高效液相色譜測定有一定的困難。

直接檢測糖類的檢測品為：示差檢測器、蒸發光散射檢測器。

為提高糖類測定的靈敏度，通常將糖類經熒光標記或紫外標記后，再采用熒光檢測器檢測。糖類的高效液相色譜檢測目前只能用于單糖和低聚糖。所采用的色譜柱為糖類檢測專用的糖分析柱，包括氨基柱和鈣離子柱。

11．紙色譜法和薄層色譜法測定

該法既可用作定性測定，也可作為半定量分析方法。

該法既可分析單糖，又可分析低聚糖。半定量分析可通過薄層掃描進行。

12．糖的氣相色譜分析

糖的氣相色譜分析一般只用于單糖的定性和定量測定。

由于糖類無特征吸收，故采用氣相色譜法檢測進，先要對糖進行衍生化。

常的衍生化方法包括：三甲基硅醚衍生化、糖腈乙酸脂衍生化、糖醇乙酸脂衍生化、三氟乙酸脂衍生化。

13．多糖的電泳分析法

電泳技術是指以電場為驅動力的一類分離分析手段。它依據樣品于一定分離介質中在電場E作用下所表現出來的速度V及其差異來分離。

用于多糖分析的電泳包括：濾紙電泳、玻璃纖維低電泳、醋酸纖維薄膜電泳、凝膠電泳、高效毛細管電泳、等電聚焦電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。

二、氨基已糖的測定

1．氨基已糖的比色測定

存在于蛋白聚糖（或糖胺聚糖）及糖蛋白中的N-取代（乙酰基或硫酸基）氨基已糖可通過鹽酸水解成游離氨基已糖（氨基葡萄糖和氨基半乳糖）釋出。氨基已糖經堿性乙酰化反應后能與對二甲氨基苯甲醛（PDABA）呈色而進行定量。又由于兩種氨基已糖在100和25℃下乙酰化程度不同，可進一步對它們作出鑒別定量。

注意：

（1）當用此法測定糖蛋白樣品中的氨基已糖時，將樣品的水解液先通過強酸型陽離子樹脂，經脫酸后，再測定。

（2）糖胺聚糖中，肝素采用本法測定氨基葡萄糖含量偏低。提高水解溫度或延長水解時間均不能改善結果。

2．N-乙酰氨基已糖的比色測定

存在于糖蛋白和蛋白聚糖（糖胺聚糖）中的N-乙酰氨基已糖經各種N-乙酰氨基已糖糖苷本科和糖胺聚糖裂解酶作用出的N-乙酰氨基已糖可利用Morgan-Elson反應進行比色測定。

注意：

（1）本法適用于游離或位于寡糖鏈還原性端基的N-乙酰氨基已糖的定量分析。

（2）N-乙酰氨基半乳糖在本比色反應條件下的吸收度僅為N-乙酰氨基葡萄糖的35%，因此制備標準曲線所用的標準糖應視所測樣品中的N-乙酰氨基已糖品種而定。

三、已糖醛酸的測定

1．已糖醛酸的比色測定

存在于聚糖，包括蛋白聚糖（或糖胺聚糖）中的已糖醛酸經含四硼酸鈉的硫酸作用后可進一步與間羥聯苯反應，開成有色物質，在520nm處有較大吸收。吸收值與該糖的濃度呈良好的線性關系。

注意：

（1）本法對葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸和半乳糖醛酸的呈色率雖有差異，但十分接近，而甘露糖醛酸的呈色率僅及葡萄糖醛酸的一半。

（2）和其它已糖醛酸比色法不同，本法不受共存的中性已糖和戊糖的干擾。此外，由于本法簡便、快速、靈敏，可取代通用的Bitter-Muir改時的咔唑-硫酸法。

2．已糖醛酸的高效液相色譜法測定

與中性糖一樣，已糖醛酸在紫外線外光、可見光、熒光下均無特征吸收，故糖類直接采用高效液相色譜測定有一定的困難。

直接檢測已糖醛酸的檢測品為：示差檢測器、蒸發光散射檢測器。

為提高測定的靈敏度，通常經熒光標記或紫外標記后，再采用熒光檢測器檢測。所采用的色譜柱為糖類檢測專用的糖分析柱，包括氨基柱和鈣離子柱。

3．已糖醛酸的氣相色譜法測定

將多糖樣品中的糖醛酸進行羧基還原，使糖醛酸還原為相應的中性糖,然后將中性糖的糖脯乙酰化衍生物用GC進行分析,通過比較羧基還原前后中性糖的變化，
推算出糖醛酸的組成。

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