細(xì)胞活力檢測：為細(xì)胞增殖與毒性研究賦能

來源：作者：人氣：-發(fā)表時間：2024-11-18 14:42:00【大中小】

細(xì)胞活力測試是評估細(xì)胞在特定條件下存活能力的重要手段，廣泛應(yīng)用于藥物篩選、生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。根據(jù)不同的測試需求和細(xì)胞類型，存在多種細(xì)胞活力測試方法及其相應(yīng)的試劑。MTT法和LDH法適用于初步評估細(xì)胞毒性或活力，而WST-8法和ATP測定法則更適合于高通量篩選和快速評估。

細(xì)胞活力檢測的常見方法

一、 MTT法

MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）是一種廣泛用于細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性研究的測定方法。該方法基于活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶活性，能夠?qū)TT還原為紫色的甲唑藍(lán)，通過測量其吸光度來評估細(xì)胞的代謝活性和存活率。

操作步驟：

首先將MTT溶液加入培養(yǎng)板中，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解甲臜，然后使用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定吸光度。

準(zhǔn)確性:

1.敏感性和特異性：MTT法被認(rèn)為是一種敏感且快速的方法，適用于多種細(xì)胞類型和條件下的細(xì)胞活力測定。例如，在比較不同方法評估哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物的活力時，MTT法顯示出較高的靈敏度。

2.定量能力：MTT法能夠提供精確的定量結(jié)果，這對于研究細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性具有重要意義。

局限性:

1.干擾因素：MTT法可能受到多種因素的干擾，如細(xì)胞培養(yǎng)基的組成、細(xì)胞釋放的內(nèi)含物（如細(xì)胞裂解液和分泌物）、以及外部添加物（如金納米粒子）等。這些因素可能影響MTT的還原和結(jié)果的解釋。

2.與其他檢測方法的不一致性：在某些情況下，MTT法的結(jié)果與其他更敏感或無干擾的方法（如ATP測定法）不一致。這表明在使用MTT法時需要謹(jǐn)慎，并考慮采用其他驗(yàn)證方法。

3.對特定藥物或化合物的反應(yīng)性：在某些特定的藥物或化合物存在下，MTT法可能無法準(zhǔn)確反映細(xì)胞的實(shí)際存活情況。例如，與多柔比星（DOX）和氟苯尼酮（FPh）共培養(yǎng)時，MTT法未能正確反映細(xì)胞存活率。

二、 WST-8法

這是一種基于細(xì)胞代謝活性的比色法，通過測定WST-8試劑在活細(xì)胞中被還原產(chǎn)生的黃色產(chǎn)物的吸光度來評估細(xì)胞活力。這種方法適用于快速、簡便的細(xì)胞活力檢測。

CCK-8 細(xì)胞活力檢測的基本原理及綜述

操作步驟：

直接將WST-8溶液加入培養(yǎng)板中，無需額外處理即可進(jìn)行檢測。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度，從而反映活細(xì)胞數(shù)量。

三、 LDH法

乳酸脫氫酶（LDH）是一種胞漿酶，當(dāng)細(xì)胞膜完整性受損時會釋放到培養(yǎng)基中。通過測定培養(yǎng)基中的LDH活性，可以間接評估細(xì)胞的存活狀態(tài)。具體步驟包括：

1、將細(xì)胞裂解，釋放LDH；

2、LDH催化乳酸氧化生成NADH，NADH與INT反應(yīng)生成甲臜；

3、甲臜的量與LDH活性成正比，通過比色法檢測吸光度來定量LDH活性。

與其他細(xì)胞活力測試方法相比，LDH法具有一定的優(yōu)勢和局限性。例如，與MTT法相比，LDH法在某些情況下顯示出更高的靈敏度和更低的背景噪音比。而在評估熱效應(yīng)對細(xì)胞活力的影響時，LDH法的靈敏度低于晶體紫染色法。

四、 ATP測定法

ATP（三磷酸腺苷）是細(xì)胞能量的直接來源，其濃度的變化可以反映細(xì)胞的活力和增殖狀態(tài)。ATP測定法通常基于生物發(fā)光反應(yīng)，即ATP與熒光素酶（一種從螢火蟲腹部提取的酶）反應(yīng)產(chǎn)生熒光。具體步驟包括：

1、使用裂解液裂解細(xì)胞以釋放ATP;

2、在熒光素酶存在下，ATP與熒光素反應(yīng)生成熒光;

3、發(fā)光強(qiáng)度與ATP濃度成正比，通過測量發(fā)光強(qiáng)度來評估細(xì)胞的活力和增殖情況。

在高通量篩選中，ATP測定法主要通過生物發(fā)光分析、基于納米粒子的檢測策略、以及基于核酸的傳感技術(shù)等方式進(jìn)行。

五、LUCS法

這是一種基于化學(xué)發(fā)光測定ATP含量，通過測定細(xì)胞內(nèi)ATP水平來反映細(xì)胞活性。ATP是細(xì)胞代謝的重要能量來源，其含量與細(xì)胞增殖和存活密切相關(guān)。

操作步驟：

將LUCS試劑加入培養(yǎng)板中，經(jīng)過一定時間孵育后，使用化學(xué)發(fā)光檢測儀測定發(fā)光強(qiáng)度，從而評估細(xì)胞活性。

實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)結(jié)果1

比較新鮮的牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）和冷凍保存后的牙周膜干細(xì)胞（cPDLSCs）的增殖率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果2

miR-34a對SRA01/04人類晶狀體上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

方法	西寶產(chǎn)品	說明
MTT法	MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）	用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測
	二甲基亞砜（DMSO）	常用的有機(jī)溶劑，用于溶解不溶于水的化合物
	含有10%胎牛血清的Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）培養(yǎng)基	哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的合成培養(yǎng)基
LDH法	磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution, PBS）	用于維持反應(yīng)體系的pH值，通常為0.10 M磷酸鹽緩沖液，pH值約為6.5
	NADH	作為LDH催化反應(yīng)中的底物之一
	丙酮酸（Pyruvate）	LDH催化反應(yīng)中的底物之一
	四唑鹽（INT）	NADH可以將四唑鹽還原成紅色的水溶性甲臜（formazan），通過測量492 nm處的吸光度來定量LDH的活性
	酚試劑（Phenazine methosulfate, PMS）	作為催化劑，幫助NADH還原四唑鹽
	Triton X-100或其他裂解劑	用于裂解細(xì)胞，釋放LDH到細(xì)胞培養(yǎng)基中
	胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）	添加一定濃度的FBS來維持細(xì)胞活性
WST-8法	WST-8 （cck-8原料）	還原生成的產(chǎn)物是水溶性的，不需要后續(xù)的DMSO溶解
ATP測定法	PBS (磷酸鹽緩沖液)	用于洗滌細(xì)胞
	GNRs-710 和 GNR-860 (兩種金納米棒)	用于細(xì)胞標(biāo)記
	ATP reagent	用于生物發(fā)光測定
	培養(yǎng)基系列

* 部分內(nèi)容來自網(wǎng)絡(luò)及論文

參考文獻(xiàn)：

1. Wu Xiang, et al. miR?34a suppresses proliferation and induces apoptosis of human lens epithelial cells by targeting E2F3. Mol Med Rep 2016 Dec;14(6):5049-5056

2. Mengying Li, et al. Effect of cryopreservation on proliferation and differentiation of periodontal ligament stem cell sheets.Stem Cell Research & Therapy volume 8, Article number: 77 (2017)