細胞活力檢測：為細胞增殖與毒性研究賦能

來源：作者：人氣：-發表時間：2024-11-18 14:42:00【大中小】

細胞活力測試是評估細胞在特定條件下存活能力的重要手段，廣泛應用于藥物篩選、生物醫學研究等領域。根據不同的測試需求和細胞類型，存在多種細胞活力測試方法及其相應的試劑。MTT法和LDH法適用于初步評估細胞毒性或活力，而WST-8法和ATP測定法則更適合于高通量篩選和快速評估。

細胞活力檢測的常見方法

一、 MTT法

MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）是一種廣泛用于細胞活力和細胞毒性研究的測定方法。該方法基于活細胞線粒體中的脫氫酶活性，能夠將MTT還原為紫色的甲唑藍，通過測量其吸光度來評估細胞的代謝活性和存活率。

操作步驟：

首先將MTT溶液加入培養板中，經過一定時間培養后，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解甲臜，然后使用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度。

準確性:

1.敏感性和特異性：MTT法被認為是一種敏感且快速的方法，適用于多種細胞類型和條件下的細胞活力測定。例如，在比較不同方法評估哺乳動物細胞培養物的活力時，MTT法顯示出較高的靈敏度。

2.定量能力：MTT法能夠提供精確的定量結果，這對于研究細胞增殖和細胞毒性具有重要意義。

局限性:

1.干擾因素：MTT法可能受到多種因素的干擾，如細胞培養基的組成、細胞釋放的內含物（如細胞裂解液和分泌物）、以及外部添加物（如金納米粒子）等。這些因素可能影響MTT的還原和結果的解釋。

2.與其他檢測方法的不一致性：在某些情況下，MTT法的結果與其他更敏感或無干擾的方法（如ATP測定法）不一致。這表明在使用MTT法時需要謹慎，并考慮采用其他驗證方法。

3.對特定藥物或化合物的反應性：在某些特定的藥物或化合物存在下，MTT法可能無法準確反映細胞的實際存活情況。例如，與多柔比星（DOX）和氟苯尼酮（FPh）共培養時，MTT法未能正確反映細胞存活率。

二、 WST-8法

這是一種基于細胞代謝活性的比色法，通過測定WST-8試劑在活細胞中被還原產生的黃色產物的吸光度來評估細胞活力。這種方法適用于快速、簡便的細胞活力檢測。

CCK-8 細胞活力檢測的基本原理及綜述

操作步驟：

直接將WST-8溶液加入培養板中，無需額外處理即可進行檢測。使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度，從而反映活細胞數量。

三、 LDH法

乳酸脫氫酶（LDH）是一種胞漿酶，當細胞膜完整性受損時會釋放到培養基中。通過測定培養基中的LDH活性，可以間接評估細胞的存活狀態。具體步驟包括：

1、將細胞裂解，釋放LDH；

2、LDH催化乳酸氧化生成NADH，NADH與INT反應生成甲臜；

3、甲臜的量與LDH活性成正比，通過比色法檢測吸光度來定量LDH活性。

與其他細胞活力測試方法相比，LDH法具有一定的優勢和局限性。例如，與MTT法相比，LDH法在某些情況下顯示出更高的靈敏度和更低的背景噪音比。而在評估熱效應對細胞活力的影響時，LDH法的靈敏度低于晶體紫染色法。

四、 ATP測定法

ATP（三磷酸腺苷）是細胞能量的直接來源，其濃度的變化可以反映細胞的活力和增殖狀態。ATP測定法通常基于生物發光反應，即ATP與熒光素酶（一種從螢火蟲腹部提取的酶）反應產生熒光。具體步驟包括：

1、使用裂解液裂解細胞以釋放ATP;

2、在熒光素酶存在下，ATP與熒光素反應生成熒光;

3、發光強度與ATP濃度成正比，通過測量發光強度來評估細胞的活力和增殖情況。

在高通量篩選中，ATP測定法主要通過生物發光分析、基于納米粒子的檢測策略、以及基于核酸的傳感技術等方式進行。

五、LUCS法

這是一種基于化學發光測定ATP含量，通過測定細胞內ATP水平來反映細胞活性。ATP是細胞代謝的重要能量來源，其含量與細胞增殖和存活密切相關。

操作步驟：

將LUCS試劑加入培養板中，經過一定時間孵育后，使用化學發光檢測儀測定發光強度，從而評估細胞活性。

實驗流程

實驗結果1

比較新鮮的牙周膜干細胞（PDLSCs）和冷凍保存后的牙周膜干細胞（cPDLSCs）的增殖率

實驗結果2

miR-34a對SRA01/04人類晶狀體上皮細胞增殖和凋亡的影響

方法	西寶產品	說明
MTT法	MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）	用于細胞增殖和細胞毒性檢測
	二甲基亞砜（DMSO）	常用的有機溶劑，用于溶解不溶于水的化合物
	含有10%胎牛血清的Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）培養基	哺乳動物細胞培養的合成培養基
LDH法	磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution, PBS）	用于維持反應體系的pH值，通常為0.10 M磷酸鹽緩沖液，pH值約為6.5
	NADH	作為LDH催化反應中的底物之一
	丙酮酸（Pyruvate）	LDH催化反應中的底物之一
	四唑鹽（INT）	NADH可以將四唑鹽還原成紅色的水溶性甲臜（formazan），通過測量492 nm處的吸光度來定量LDH的活性
	酚試劑（Phenazine methosulfate, PMS）	作為催化劑，幫助NADH還原四唑鹽
	Triton X-100	用于裂解細胞，釋放LDH到細胞培養基中
	胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）	添加一定濃度的FBS來維持細胞活性
WST-8法	WST-8 （cck-8原料）	還原生成的產物是水溶性的，不需要后續的DMSO溶解
ATP測定法	PBS (磷酸鹽緩沖液)	用于洗滌細胞
	GNRs-710 和 GNR-860 (兩種金納米棒)	用于細胞標記
	ATP reagent	用于生物發光測定
	培養基系列

* 部分內容來自網絡及論文

參考文獻：

1. Wu Xiang, et al. miR?34a suppresses proliferation and induces apoptosis of human lens epithelial cells by targeting E2F3. Mol Med Rep 2016 Dec;14(6):5049-5056

2. Mengying Li, et al. Effect of cryopreservation on proliferation and differentiation of periodontal ligament stem cell sheets.Stem Cell Research & Therapy volume 8, Article number: 77 (2017)