以外泌體為代表的細胞外囊泡是各個細胞釋放出的膜囊泡，它作為細胞間信息傳遞的使者和疾病生物標志物，近年來受到了極高的關注wai。雖然近幾年有關外泌體的研究在各領域中不斷增長，但實驗技術尚在發展階段，還存在很多需要改善的問題。FUJIFILM Wako開發了一種新的親和分離法——"PS親和法"，與傳統方法相比，能從各種樣品中提取出完整且高純度的外泌體，而且，該技術還成功開發出用于外泌體檢測的PS親和ELISA法）。

在研究外泌體時，為了評價分離和提取出的外泌體的生物活性，通常會對細胞或動物進行投喂實驗。利用熒光素標記進行可視化來確認對象中含有外泌體并進行追蹤，是一種常見的技術。但是，如上述所說，外泌體的實驗技術仍在發展，熒光素標記還存在需要注意的問題。本文講述的是使用了不同品牌的熒光標記色素進行外泌體標記的研究，以及需要注意的問題。

各品牌都將脂質、核酸或細胞膜的熒光標記試劑加以改造，使之成為包括外泌體在內的細胞外囊泡的特異熒光標記試劑。該標記方法是讓從各個樣品中分離、提取出來的外泌體樣品與熒光色素進行反應，通過凝膠過濾或超濾裝置去除未反應的熒光色素。在該熒光標記的過程中，特別是去除未反應的熒光標記時，會因吸附而損失大量的外泌體樣品，同時，通過向外泌體樣品添加FUJIFILM Wako開發的EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent（下面簡稱EV-Save），能強烈抑制吸附損失（圖1）。用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS從COLO201細胞培養上清中分離、提取外泌體樣品，先用A公司的熒光標記試劑進行標記，然后用B公司的凝膠過濾柱去除未反應色素。將獲得的熒光標記外泌體樣品加入HeLa細胞培養上清中，經過24小時的細胞吸收后，用熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測。在熒光色素標記時預先向樣品中加入EV-Save，結果顯示，細胞內的熒光信號比未添加EV-Save時大幅增強（圖1、A, B）。用PS Capture™ Exosome ELISA Kit后再比較凝膠過濾前后外泌體樣品的吸附損失， 未添加EV-Save的樣品在凝膠過濾后沒被檢測到外泌體表面標記物CD63的信號，而添加了EV-Save的樣品則檢測到了CD63的信號，所以，EV-Save能有效抑制凝膠過濾引起的吸附損失（圖1、C）。

圖1．熒光標記外泌體樣品的吸收確認與EV-Save抑制吸附損失的效果

用A公司的熒光標記試劑對MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS分離的COLO201來源外泌體樣品（1×10¹⁰particles）進行標記后，再用熒光顯微鏡（A）和流式細胞儀（B）確認HeLa細胞吸收外泌體樣品的情況。
準備同上的外泌體樣品（5×10⁹particles），可以用PS Capture™ Exosome ELISA Kit比較CD63信號來檢測凝膠過濾前后的損失（C）。

下面將對使用不同熒光標記試劑的外泌體熒光標記以及細胞的吸收能力進行比較。這次使用的是A、B、C公司的熒光標記試劑。用各種熒光標記試劑熒光標記以MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS從COLO201細胞培養上清中提取的外泌體樣品，再確認HeLa細胞對外泌體樣品的吸收情況（圖2、A, B）。熒光顯微鏡觀察發現，細胞內吸收了用不同熒光標記的外泌體（圖2、A），且根據流式細胞分析，比較無添加對照以及標記Elution buffer的陰性對照，峰值位移大幅改變，所以能確定受體細胞吸收了熒光標記的外泌體（圖2、B）。但是，用熒光標記試劑來標記1% BSA 溶液作為陰性對照，與其他樣品一樣加入細胞后，和熒光標記的外泌體樣品進行同樣的處理，在流式細胞分析中也觀察到了峰值的變化（圖2、B）。對此，各種熒光色素標記試劑不僅對外泌體，同樣的原理它對蛋白也能進行標記，故在用作外泌體標記試劑時，特異性是一個較嚴重的問題。從上述結果可見，用市面上銷售的熒光標記試劑進行標記，或進行細胞吸收外泌體的確認實驗時，受體細胞中的熒光信號是外泌體本身的信號，還是外泌體分離時受污染的蛋白等雜質來源的信號，解釋結果時需要特別注意，故在進行細胞吸收外泌體的確認驗證時，外泌體樣品純度非常重要。

圖2．使用了各種熒光標記試劑的外泌體標記與外泌體被HeLa細胞吸收的確認

用各種熒光標記試劑對MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS分離的COLO201 來源外泌體樣品（1× 1010 particles）進行標記，再用熒光顯微鏡（A）和流式細胞儀（B）確認HeLa細胞對外泌體樣品的吸收情況。另外，作為對照，還準備了同樣進行過熒光標記處理的試劑盒附帶的Elution buffer和1%BSA 溶液，然后添加到細胞中（B）。

因此，通過FUJIFILM Wako PS親和法和超離法從相同量的培養上清樣品中分離、提取出外泌體樣品，再用A公司的熒光標記試劑標記外泌體樣品，進行細胞吸收外泌體的確認實驗（圖3）。熒光顯微鏡的分析結果表明，受體細胞吸收的由超離法分離、提取出的外泌體樣品比PS親和提取的外泌體樣品更多（圖3、A）。但是，詳細分析提取外泌體樣品時，盡管蛋白濃度和粒子數分析顯示出超離樣品含有更多的外泌體量，但是如果用PS Capture™ Exosome ELISA Kit檢測外泌體標記物CD63信號，PS親和法分離、提取的樣品比用超離法分離、提取的外泌體樣品的一個粒子的CD63信號和純度更高（圖3、B）。使用雜質多、污染嚴重的超離法制備外泌體樣品時，受體細胞吸收的信號實體不僅來源于外泌體，也可能來源于雜質蛋白。

圖3．比較PS親和提取與超離提取外泌體的吸收的效率

用A公司的熒光標記試劑對用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS和超離法分離的COLO201來源的外泌體樣品（8×10⁹particles）進行標記，然后在熒光顯微鏡下比較HeLa細胞吸收外泌體的效率（A）。各提取法配制的外泌體樣品，以BCA assay 檢測蛋白濃度，使用NanoSight的NTA檢測粒子數，同時，通過PS親和ELISA法檢測CD63的信號（B）。

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產品編號	產品名稱	規格	包裝
058-09261	EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent EV-Save™ 細胞外囊泡吸附抑制劑	研究用	1mL

在進行外泌體的熒光標記法和細胞吸收外泌體的確認時應該注意的兩點是，外泌體具有的吸附特性與收量低下密切相關，現在市面上銷售的熒光標記試劑不是以外泌體染色為目的而開發的，對外泌體的特異性較低。對于如何配制高純度的外泌體樣品，本文提出了分離、提取方法的重要性。但是至今為止，如多數論文報告主要采用的那樣，分離、提取含有外泌體的細胞外囊泡的方法的黃金標準仍然是超離法，但實際上，超離法配制出的外泌體樣品會混入很多非細胞外囊泡來源的雜質蛋白，我們仍在繼續徹底評估污染物對下游實驗結果的影響。International Society for Extracellular Vesicles的雜志《Journal of Extracellular Vesicles》也提到過這個問題4）。以FUJIFILM Wako開發的"PS親和法"為基礎的MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS還有待改善，但它比超離法和各種分離、提取試劑盒能相比，能更簡便地提取高濃度的外泌體。衷心希望在未來FUJIFILM Wako的產品能有助于以外泌體為代表的細胞外囊泡研究的進一步發展。

1） Tkach, M. et al . : Cell , 164, 1226（2016）.
2） Nakai, W. et al . : Sci. Rep ., 6, 33935（2016）.
3） Saito, S. et al . : Sci. Rep ., 8, 3997（2018）.
4） Gardiner C. et al . : J. Extracell. Vesicles , 5, 32945（2016）

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