新一代CRISPRs有望成為2015年重磅技術

來源：生物谷作者：人氣：-發表時間：2015-01-06 09:35:00【大中小】

當人們提到所謂的使能技術（enabling technologies），類似印刷機的發明，或者麻醉藥的發現就會浮現在我們腦海中。而對于科學家來說，CRISPR-Cas9系統就是這樣一種系統。

這種細菌免疫系統能通過將病毒DNA中的短重復片段整合到細菌基因組中，來抵抗病毒。當細菌（或其后代）第二次感染病毒的時候，這些重復序列就能通過一種核酸酶靶向侵入的互補DNA，并摧毀它。

2013年幾個研究組就利用了這一系統編輯真核生物基因，隨后看到在不少應用中CRISPRs迅速崛起，多個不同物種都實現了基因組中基因刪除和插入，激活或抑制基因轉錄。但是隨著這一系統越來越受歡迎，關于其特異性和有效性的質疑也越來越多。

如何提高導向RNA（gRNA）的特異性是一大問題，這種RNA能將Cas9核酸酶帶領到基因組目標位置，Nature Biotechnology雜志建議切斷gRNAs (Nature子刊：巧解基因編輯脫靶問題)，減少脫靶問題，而且不影響靶標活性，而另外一個研究組則建議更長一些的gRNAs(Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases)。

這明顯是有些自相矛盾的建議，前者的研究人員指出只是簡單截短了gRNA靶標區域的長度，結果發現在之前檢測到的脫靶位點，脫靶突變都大幅減少，與全長gRNA相比，一些位點的突變頻率甚至減少了5，000倍以上。重要的是在靶向它們的預定目標DNA時，這些縮短了的gRNA（稱為tru- gRNA）與全長gRNA同樣有效。而后者則發現選擇合適的靶標序列，優化gRNA和Cas9，就能避免或者減少脫靶突變的出現。

另外一個問題是如何篩選脫靶，以及中對于研究的影響有多少?？梢则炞CgRNAs錯配候選位點的方法也許會錯失一些關鍵的剪切位點，而且全基因組測序也不是非常有效，目前我們需要一種敏感且無偏差的方法，來標記Cas9 靶標位點，并令它們能在整個基因組中被識別出來。

其它的令這一系統特異性更強的方法還有，用配對替換切口酶（nickases）替換Cas9核酸酶（前者每次只能切斷DNA一條鏈），或者將Cas9突變融合到Fok1這種需要催化激活的核酸酶中去。此外，通過來自不同物種的Cas9也能增加靶向多個位點的靈活性，進一步改善Cas9-gRNA復合物的傳遞系統，也有助于增加效率。

盡管Cas9潛力無限，但是這還是一種細菌的蛋白，對于一些應用，尤其是臨床上的應用來說，還需要尋找真核生物核酸酶進行替換。對于植物來說，一些Argonaute 核酸酶能通過小RNAs靶向DNA，這也是基因組編輯可以考慮的一個方向。