原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)方案

來(lái)源：作者：人氣：-發(fā)表時(shí)間：2015-10-08 16:53:00【大中小】

原核表達(dá)，廣義上是指發(fā)生在原核生物內(nèi)的基因表達(dá)。狹義上是指通過(guò)基因克隆技術(shù)，將外源目的基因，通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體并導(dǎo)入表達(dá)菌株的方法，使其在特定原核生物或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，通常出現(xiàn)在生物工程中。

一、實(shí)驗(yàn)原理

1、E.coli 表達(dá)系統(tǒng)

E.coli 是重要的原核表達(dá)體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入E.coli 菌株以后，通過(guò)溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS-PAGE

以檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)。

2、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)

提高外源基因表達(dá)水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長(zhǎng)與外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，以減輕宿主菌的負(fù)荷。常用的有溫度誘導(dǎo)和藥物誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。

不同的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)方法并不完全相同，因啟動(dòng)子不同，誘導(dǎo)表達(dá)要根據(jù)具體情況而定。

二、實(shí)驗(yàn)試劑的準(zhǔn)備

1、誘導(dǎo)表達(dá)材料

(1)LB（Luria—Bertani）)培養(yǎng)基

酵母膏(Yeast extract)5g 蛋白胨(Peptone)10g

NaCl10g 瓊脂(Agar)1-2%

蒸餾水(Distilled water)1000ml pH7.0

適用范圍：大腸桿菌

(2)IPTG 貯備液：2 g IPTG溶于10 ml 蒸餾水中，0 .22 μm 濾膜過(guò)濾除菌，分裝成1 ml /份，－20 ℃ 保存。

(3)l× 凝膠電泳加樣緩沖液：

50 mmol / L Tris-CI (pH6.8)

50 mmol / L DTT

2 % SDS（電泳級(jí)）

0.1 % 溴酚藍(lán)

10 % 甘油

2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料

1）酶溶法

（1）裂解緩沖液：

50 mmol / L Tris-Cl (pH8.0)

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCl

（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF）。

（3）10 mg / ml 溶菌酶。

（4）脫氧膽酸。

（5）1 mg / ml DNase I。

2）超聲破碎法

(1)TE 緩沖液。

(2)2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：

100 mmol / L Tris-HCI (pH8.0)

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 % 溴酚藍(lán)

20 % 甘油

三、實(shí)驗(yàn)方案

1、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)

(1）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切核酸酶消化載體DNA 和目的基因。

(2）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌。

(3）篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落，提取質(zhì)粒DNA 作限制性?xún)?nèi)切核酸酶圖譜，DNA 序列測(cè)定，確定無(wú)誤后進(jìn)行下一步。

(4）如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為PL 啟動(dòng)子，則在30 -32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，使培養(yǎng)液的OD600達(dá)0.4-0.6 ，迅速使溫度升至42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3-5h ；如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為tac 等，則37 ℃培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續(xù)培養(yǎng)3-5h 。

(5）取上述培養(yǎng)液1ml ,1000g 離心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后，作SDS-PAGE 檢測(cè)。

2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化

1）細(xì)菌的裂解

常用方法有：① 高溫珠磨法；② 高壓勻漿；③ 超聲破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化學(xué)滲透等。前三種方法屬機(jī)械破碎法，并且方法① 、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用，后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實(shí)驗(yàn)步驟。

（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對(duì)細(xì)菌類(lèi)有作用，而其他幾種酶對(duì)酵母作用顯著。主要步驟為：

① 4 ℃ ，5000rpm 離心，15 min ，收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液（100 ml）。棄上清，約每克濕菌加3 ml 裂解緩沖液，懸浮沉淀。

② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，攪拌20 min ；邊攪拌邊每克菌加4 mg 脫氧膽酸（在冷室中進(jìn)行）。

③ 37 ℃ ，玻棒攪拌，溶液變得粘稠時(shí)加每克菌20μL DNase I。室溫放置至溶液不再粘稠。

（2）超聲破碎法。聲頻為15-20 kHz 的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以進(jìn)行細(xì)胞破碎，在處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便，液體量損失較少，同時(shí)還可對(duì)染色體DNA

進(jìn)行剪切，大大降低液體的粘稠度。

① 收集1 L 誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，40 ℃ ，5000r pm 離心，15 min ；棄上清，約每克濕菌加3 mlTE 緩沖液。

② 按超聲處理儀廠家提供的功能參數(shù)進(jìn)行破菌；10 000g 離心，15min ，分別收集上清液和沉淀。

③ 分別取少量上清和沉淀，加入等體積的2× 凝膠電泳加樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE 。

注意事項(xiàng)：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度、菌種類(lèi)型等因素有關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前，標(biāo)本經(jīng)3-4次凍溶后更容易破碎。

2）包涵體的分離

蛋白質(zhì)在細(xì)菌中的高水平表達(dá)，常形成相差顯微鏡下可見(jiàn)到的細(xì)胞質(zhì)顆粒，即為包涵體，經(jīng)離心沉淀后可用Triton-X100 / EDTA 或尿素洗滌，若為獲取可溶性的活性蛋白，須將洗滌過(guò)的包涵體重新溶解并進(jìn)行重折疊。

（1）試劑與配制

① 洗滌液I：

0.5 % Triton X -100

10 mmol / L EDTA (pH8.0)

溶于細(xì)胞裂解液中。

② 2×凝膠電泳加樣緩沖液。

（2）細(xì)胞裂解混合物12 000g 離心，15 min ,4 ℃ ；棄上清，沉淀用9× 洗滌液l 懸浮；室溫放置5 min ; 12 000g 離心15 min ,4 ℃ ；吸出上清，用100 μL 水重新懸浮沉淀；分別取10 μL上清和重新懸浮的沉淀，加10 μL 2× 凝膠電泳加樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE 。

3）包涵體的溶解和復(fù)性

（1）試劑與配制

① 緩沖液I：

1 mmol / L PMSF

8mol /L 尿素

10 mmol / L DTT

溶于前述裂解緩沖液中。

② 緩沖液Ⅱ：

50 mmol / L KH2PO4

1 mmol / L EDTA(pH8.0)

50 mmol / L NaCl

2 mmol / L 還原型谷胱甘肽

1 mmol / L 氧化型谷胱甘肽

③ KOH 和HCl 。

④ 2×凝膠電泳加樣緩沖液。

（2）用100μL緩沖液I 溶解包涵體；室溫放置lh ；加9×緩沖液Ⅱ，室溫放置30 min ，用KOH 調(diào)pH到10.7 ；用HCI 調(diào)至pH8.0，在室溫放置至少30min;1000g離心15min，室溫；吸出上清液并保留，用100μL2×凝膠電泳加樣緩沖液溶解沉淀；取10μL上清，加10μL2× 凝膠電泳加樣緩沖液，與20μL 重新溶解的沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 。

四、注意事項(xiàng)

（1）不同的大腸桿菌表達(dá)載體帶有不同的啟動(dòng)子和誘導(dǎo)成分。實(shí)驗(yàn)者必須根據(jù)特定系統(tǒng)和用途決定相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案。

（2）表達(dá)和檢測(cè)時(shí)，應(yīng)設(shè)置對(duì)照組，如轉(zhuǎn)化載體和非誘導(dǎo)細(xì)胞。

（3）由于大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)缺少哺乳動(dòng)物細(xì)胞特異的翻譯后加工，所以，其生物活性無(wú)法與天然蛋白質(zhì)相提并論。

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