用于檢測(cè)【甲氧基聚乙二醇】和【聚乙二醇化蛋白】的ELISA試劑盒（MP-0001-1Kit）

來(lái)源：作者：人氣：-發(fā)表時(shí)間：2015-08-28 10:51:00【大中小】

用于檢測(cè)【甲氧基聚乙二醇】和【聚乙二醇化蛋白】的ELISA試劑盒（MP-0001-1Kit）

甲氧基聚乙二醇 ELISA試劑盒(貨號(hào)：MP-0001-1Kit)的應(yīng)用： 用于檢測(cè)分子量大于等于2kDa 游離甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇化蛋白，試劑盒只用于科研，不可用于診斷或治療

甲氧基聚乙二醇 ELISA試劑盒(貨號(hào)：MP-0001-1Kit)產(chǎn)品介紹：
治療蛋白通過(guò)結(jié)合甲氧基聚乙二醇鏈實(shí)現(xiàn)聚乙二醇化，蛋白聚乙二醇化后，可減緩蛋白水解和循環(huán)系統(tǒng)清除速率來(lái)延長(zhǎng)半衰期，因此可以增加其療效。評(píng)估聚乙二醇化蛋白的藥效，通常情況下應(yīng)對(duì)多肽鏈的特異性進(jìn)行分析。但這些方法需要消耗大量時(shí)間，且建立目標(biāo)蛋白的ELISA很昂貴。甲氧基聚乙二醇 ELISA試劑盒(貨號(hào)：MP-0001-1Kit)可以檢測(cè)甲氧基聚乙二醇鏈，因此適合評(píng)估聚乙二醇化生物制劑和甲氧基聚乙二醇的藥效。

該檢測(cè)試劑盒基于夾心ELISA原理，它應(yīng)用了兩個(gè)抗-PEG小鼠單克隆抗體。針對(duì)PEG的聚乙二醇主鏈的特異性抗體包被在96孔板上，用于捕獲。另外一種專一性抗體結(jié)合了辣根過(guò)氧化物酶，與甲氧基聚乙二醇的末端甲氧基發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)行檢測(cè)。

甲氧基聚乙二醇 ELISA試劑盒可用于檢測(cè)游離甲氧基聚乙二醇（圖1）和帶有一個(gè)或多個(gè)甲氧基聚乙二醇鏈的聚乙二醇化蛋白（圖2）。不過(guò)，它不能檢測(cè)缺少末端甲氧基的PEG鏈。試劑盒的靈敏度隨著甲氧基聚乙二醇鏈的長(zhǎng)度而變化，因此甲氧基聚乙二醇或聚乙二醇化的分子可以生成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。研究表明，甲氧基聚乙二醇 ELISA試劑盒可識(shí)別分子量大于等于2kDa的甲氧基聚乙二醇。試劑盒提供5kDa 甲氧基聚乙二醇-氨的標(biāo)準(zhǔn)品，可方便用戶去檢測(cè)試劑盒的性能。

甲氧基聚乙二醇 ELISA試劑盒(貨號(hào)：MP-0001-1Kit)分析方法：
首先將100ul的HRP抗-甲氧基聚乙二醇加入到微孔板中，然后加入100ul的稀釋樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，在微孔板振蕩器上混勻1小時(shí)。沖洗微孔以后，加入100ul的TMB到微孔中，孵育20分鐘，結(jié)果會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色。加入1N HCL 100ul終止反應(yīng)，藍(lán)色會(huì)變?yōu)辄S色，檢測(cè)其在450nm處的吸光值。甲氧基聚乙二醇的濃度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得。

甲氧基聚乙二醇 ELISA試劑盒(貨號(hào)：MP-0001-1Kit)包含以下內(nèi)容：

抗-PEG包被的96孔板（12個(gè)可拆開(kāi)的條，每條8孔），在-20℃下儲(chǔ)存
HRP 抗-甲氧基聚乙二醇復(fù)合物，25ul（1瓶）。在-20℃下儲(chǔ)存
甲氧基聚乙二醇稀釋液，50ml
5kDa 甲氧基聚乙二醇-氨標(biāo)準(zhǔn)品，100ul（1瓶）。在-20℃下儲(chǔ)存
甲氧基聚乙二醇清洗緩沖液，60ml
TMB試劑，11ml
終止液，11ml

需提供以下試劑或耗材：

移液器和槍頭
蒸餾水或去離子水
聚丙烯或玻璃管
漩渦混合器
微孔板振蕩儀（混合速度，150轉(zhuǎn)/分鐘）
平板墊圈
在450nm處光密度在0-4的平板閱讀器
繪圖軟件

標(biāo)準(zhǔn)液的制備：

1、標(biāo)記8支聚丙烯管或玻璃管，濃度為20,10,5,2.5,1.25,0.625，0.3125和0ng/ml
2、制備20ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)記在5kDa 甲氧基聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上
3、加入250ul的稀釋液到管中，標(biāo)記為10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125和0ng/ml
4、吸取250ul的20ng/ml 甲氧基聚乙二醇標(biāo)準(zhǔn)品到管子中，標(biāo)記10ng/ml，并混合。此試劑盒提供10ng/ml PEG-BSA標(biāo)準(zhǔn)品。
5、通過(guò)連續(xù)稀釋相同地制備5,2.5,1.25,0.625和0.3125ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品

分析過(guò)程：

1、保護(hù)支持板上合適數(shù)量的包被孔
2、加入100ul的HRP 抗-甲氧基聚乙二醇復(fù)合物到孔中
3、吸取100ul標(biāo)準(zhǔn)品和樣品到孔中（建議標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別一式三份）
4、在150轉(zhuǎn)每分鐘的微孔板振蕩器上室溫（25℃）孵育1小時(shí)
5、使用一個(gè)平板墊圈，清洗孔6次，每孔加入400ul的清洗液
6、吸取100ul的TMB試劑到每個(gè)孔中
7、在150轉(zhuǎn)/分鐘的微孔板振蕩器上輕輕地混合20分鐘
8、加入100ul的終止液到每個(gè)孔中終止反應(yīng)
9、輕輕混合直到藍(lán)色變?yōu)辄S色
10、5分鐘內(nèi)讀取450nm處的吸收值

結(jié)果計(jì)算：

1、讀取參考標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在450nm處的平均吸光值
2、用平均吸光值和濃度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y軸是吸光值，X軸是濃度
3、用合適的模型和電腦繪圖軟件導(dǎo)入數(shù)據(jù)
4、使用每個(gè)樣品的平均吸光值來(lái)確定甲氧基聚乙二醇或聚乙二醇化蛋白的濃度值
5、濃度乘以稀釋因子計(jì)算出血清或血漿樣品中聚乙二醇化蛋白的實(shí)際濃度
6、如果樣品的吸光度值不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，樣品需要重新稀釋和檢測(cè)

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