Francisco Mojica并不是第一個觀察到CRISPR的研究者，但他卻是第一個被CRISPR“深深打動”的人，他還記得，1992年的某一天當他首次看到微生物的免疫系統時，他就認為這或許能夠帶來一場生物技術的變革，隨后Francisco Mojica對來自地中海富鹽菌(Haloferax mediterranei)的基因組數據進行了分析，發現了14個不尋常的DNA序列，每個序列都有30個堿基對，這些序列的閱讀順序從前往后或從后往前都是相同的，而且會每隔35個堿基進行重復。

科學家深入解析CRISPR起源

當時這項研究發現并不是很受歡迎和重視，如今研究者以CRISPR來對成簇規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)進行命名，同時他們還發現，CRISPR-Cas能夠幫助細菌抵御外來病毒的入侵，盡管CRISPR系統能夠用來進行基因的編輯，但Mojica和其它研究者們關于該系統的工作機制仍然存在一些問題，這種微生物免疫系統是如何進化的？又是如何塑造微生物的免疫系統的？為何有些微生物能夠使用其來抵御外來入侵病毒，而有些微生物則不能？

加利福尼亞大學的研究者Jennifer Doudna表示，近年來媒體對CRISPR系統帶來的技術變革進行了大量的關注，如今基于該技術我們也看到了其所帶來的不可思議的影響和機會，同時還有很多基礎生物學的領域需要我們去深挖。

CRISPR從哪兒來

諸如CRISPR–Cas等系統的生物學優勢顯而易見，原核生物，比如細菌和古細菌，都會面對遺傳入侵者的強烈攻擊，而病毒會以遠超細菌的數量來對細菌進行剿滅，而原核生物常常會交換一些片段，比如質粒，其能夠吞噬來自宿主的資源，并且驅動宿主自我毀滅；與此同時原核生物還會進化出大量“武器”來應對病毒等外界威脅，比如限制性內切酶，其就是一種能夠切斷特殊位點或附近DNA的蛋白質，但原核生物的這些防御工事并不是很“鋒利”，每一種酶都會被編程識別特定的序列，而當存在合適基因的拷貝時才會為微生物提供保護作用，而CRISPR–Cas系統就具有動態性的變化，其能夠適應并且記住特殊遺傳特性的外來入侵者，而這種方式就類似于在感染后人類機體抗體提供的長效免疫保護力一樣，來自荷蘭瓦赫寧根大學的研究者John van der Oost表示，當我們首次聽到這種假設時，我們認為這對于簡單的原核生物而言非常復雜。

隨后當研究者Mojica及其同事觀察到CRISPR的回文重復序列有時候能同病毒基因組進行匹配時，他們對CRISPR–Cas系統的功能進行了解析，從那時候開始，研究人員就開始對CRISPR相關的特殊蛋白（Cas蛋白）進行研究，當細菌遭受特殊病毒或質粒時，這種特殊蛋白能夠將間隔區序列添加到細菌的基因組中，而間隔區序列制造的RNA還能夠指導其它Cas蛋白切割外來DNA或RNA。

那么細菌和古細菌是如何擁有這些復雜免疫系統的呢？這個問題還有待于科學家進一步研究解答，如今一種主流的理論認為，基于轉座子（跳躍基因）的系統能夠從基因組中的一個位點跳躍到另一個位點；進化生物學家Eugene Koonin及其同事通過研究發現了一類能夠編碼Cas1蛋白的遺傳移動元件，該元件能夠插入到基因組的間隔區域中去，而這些“casposons”元件或許也是CRISPR–Cas免疫力的起源，如今研究者正在通過研究理解這些少量的DNA如何從一個位點跳躍到另一個位點，隨后他們將繼續通過研究追蹤誘發CRISPR–Cas系統變得復雜的分子機制。

CRISPR如何工作的

近些年來科學家們通過研究闡明了Cas蛋白添加間隔區的多種分子機制，但病毒的DNA在化學結構上同宿主的DNA幾乎相同，那么蛋白質如何知道哪種DNA能夠被添加到CRISPR–Cas記憶系統中呢？

這樣的“賭注”往往是很高的，如果細菌添加了自身的DNA片段，自身免疫攻擊就會增加自殺的風險，因此細菌和古細菌有時候就會吸收一些錯誤，如果細胞在遭受病毒攻擊后依然生長旺盛的話，少數細胞自殺可能并不太重要。實際上，當病毒潛入細菌生態系統中時，僅有千萬分之一的細菌會獲得能夠為自身防御的間隔區，而且研究者對于研究驅動間隔區的機制也非常困難。

研究者表示，如何有效識別合適的間隔區非常重要，有些研究就表明，包含CRISPR–Cas分子機器的細胞或許能夠充當多種多樣的記錄設備，其能夠對遇到過的DNA和RNA序列進行分類，這就能夠幫助研究人員追蹤細胞中基因的表達或對環境化學物質的暴露情況；研究人員還想通過研究來闡明細菌中的這種古老記憶如何被修改，很多攜帶CRISPR–Cas系統的微生物都包含有十幾個間隔區，而有些微生物則僅有1個間隔區，相比較而言，嗜熱古細菌將其1%的基因組貢獻給了5個CRISPR–Cas系統，其中包括458個間隔區。

目前在尋找古老間隔區上研究者積極性并不高，如果病毒會發生來避免CRISPR–Cas，那么間隔區或許就會退化，而且其或許會成為微生物保持額外DNA的負擔。

一些間隔區的起源還會展現出另外一些奧秘，目前研究人員在DNA數據庫中發現，不到3%的間隔區能夠同一些已知的序列相匹配。大部分的測序結果都主要集中于受感染的人、牲畜或作物；在某些細菌中，CRISPR–Cas組分能夠控制DNA的修復、基因表達和生物被膜的形成，其同時還能夠幫助確定細菌感染諸如嗜肺軍團菌等其它細菌的能力，嗜肺軍團菌能夠誘發軍團病，該菌必須含有Cas2蛋白來感染其天然宿主—變形蟲。

研究者Erik Sontheimer表示，研究人員同時還做出了一個平行的發現，那就是RNA干擾技術，該技術能夠沉默植物、動物以及其它非原核生物有機體中的基因表達，之前研究者認為RNA干擾是有機體中的一種天然防御機制，此后研究者才注意到RNA干擾在調節宿主基因表達中所扮演的角色。代爾夫特理工大學的研究人員Stan Brouns表示，這或許能夠解釋為何某些間隔區并不能夠與病毒或質粒進行匹配。

某些微生物能夠使用CRISPR–Cas系統

不論CRISPR–Cas系統是否還具有其它功能，目前很明確的是，相比其它微生物而言，有些微生物能夠很好利用該系統，有超過90%的古細菌都有基于CRISPR的免疫力，然而僅有三分之一被測序的細菌會被該系統所干擾。

大量的輸血模型和早期的實驗室研究都表明，CRISPR–Cas可能具有更多的優勢，尤其是當同一些病毒做斗爭的時候尤為明顯，當添加的DNA轉變成為基因組負擔之前，CRISPR–Cas系統的間隔區往往能夠記錄非常有限數量的病毒序列，如果環境中病毒的多樣性遠遠超過可能的間隔區數量時，CRISPR–Cas可能就沒有那么有用了；另外一種可能性就是外部環境中的古細菌并不會依賴其它的防御手段，細菌抵御外來入侵者的常用方法就是對細菌外膜進行突變，而某些古細菌并不能夠自由地修補這些外膜，因為外膜結構對于其在極端環境下生存只管中喲啊，這就使得諸如CRISPR的替代系統變得更加重要了。

人們更傾向于關注CRISPR–Cas9系統，因為該系統在基因組編輯上具有簡單性和多樣性，但微生物并不會對其偏愛，相反其會將該系統與其它不同的系統混合并且匹配，從而快速從其它細菌中選出新型系統而剔除掉古老的系統。

如今研究者正式鑒別出了6種不同類型的CRISPR系統，包括19個亞型，然而研究者僅僅知道其中一部分工作的機制。闡明這些CRISPR系統的工作機制對于研究人員發現CRISPR-Cas9系統的新型生物技術應用非常關鍵，比如研究者們所鐘愛的CRISPR-Cas9就是一種II型系統，其能夠利用間隔區轉錄的RNA分子來指導酶類對外來病毒和質粒DNA進行切割，但去年研究人員發現的VI型系統中的酶類卻能夠切割RNA，而且該系統中包含有和CRISPR-Cas9相關的某些基因，但同時又缺少能夠插入到間隔區中的一些重復序列。

研究者Doudna表示，III型系統就是研究者發現的最為常見的CRISPR–Cas系統，目前有研究證據表明，CRISPR–Cas并不會對外來DNA或RNA產生反應，但卻會對DNA轉錄到RNA的過程產生反應，如果被證明這是事實的話，那么其或許能夠作為一種新型的調節形式來擴展CRISPR-Cas9用于基因組編輯的“工具箱”。

對于研究者Mojica而言，深入剖析和CRISPR相關的諸多基本問題往往比進行革命性的研究發現要更有吸引力，他癡迷于CRISPR-Cas9研究已經將近25年了，但后期他們還需要在這一領域內進行更多的研究。Mojica說道，我知道這是一種強大的工具，其能夠用來治療多種人類疾病，但我更關心的是闡明該系統如何自始至終地進行工作的。

【1】Five big mysteries about CRISPR’s origins

【2】Casposons： a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Cas immunity
BMC Biology DOI： 10.1186/1741-7007-12-36

【3】Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR–Cas adaptive immunity
Nature doi：10.1038/nature14237

【4】Molecular recordings by directed CRISPR spacer acquisition
Science DOI： 10.1126/science.aaf1175

【5】Viral Diversity Threshold for Adaptive Immunity in Prokaryotes
mBio doi： 10.1128/mBio.00456-12

【6】Biochemical studies of tast sensation. Binding of L-[3H]alanine to a sedimentable fraction from catfish barbel epithelium.
J Biol Chem https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/403？dopt=Abstract&holding=npg

【7】C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector
Science DOI： 10.1126/science.aaf5573