重大突破！我國顏寧課題組從結構上揭示人Ptch1蛋白識別Shh機制
Hedgehog（Hh）通路對胚胎發生和組織再生是至關重要的。Hh信號是通過分泌的和脂質修飾的蛋白Hh結合到膜受體Patched（Ptch）上而被激活的。在缺乏Hh的情況下，Ptch通過一種未知的間接機制抑制下游的G蛋白偶聯受體Smoothened（Smo）。
Hh與Ptch的結合減輕了對Smo的抑制并且開啟讓Hh通路遭受轉錄激活的信號轉導事件。Hh信號異常與出生缺陷或腫瘤發生有關。盡管進行了嚴密的研究，Hh、Ptch和Smo之間相互作用的分子基礎仍是不清楚的，而且Ptch和Hh之間識別的結構基礎還有待闡明。
經預測長1447個氨基酸殘基的人Ptch1蛋白含有12個跨膜區段（TM），并且與細菌RND家族轉運蛋白（resistance-nodulation-division family transporter, RND家族轉運蛋白）存在著結構類似性。Ptch1的跨膜區段2（TM2）至TM6構成固醇敏感多肽區（sterol-sensing domain, SSD）。人們已在幾種參與固醇轉運和代謝的蛋白中發現了SSD。這些含有SSD的蛋白的潛在固醇結合或轉運活性的分子機制仍然是不清楚的。
圖片來自Science, doi:10.1126/science.aas8935。
在一項新的研究中，為了獲得適合于結構研究的樣品，來自中國清華大學的研究人員基于序列保守性和功能表征獲得幾種人Ptch1的構建體。最終，在人胚胎腎293F細胞中瞬時表達的含有氨基酸殘基1～1305的人Ptch1截短版本在親和層析純化和尺寸排阻層析純化后表現出足夠的表達水平和良好的溶液行為。他們還觀察了Ptch1的寡聚體狀態和單體狀態。Ptch1的單體形式可適用于單粒子低溫電子顯微鏡分析，這是因為它在低溫條件下具有優異的性能。相關研究結果發表在2018年8月10日的Science期刊上，論文標題為“Structural basis for the recognition of Sonic Hedgehog by human Patched1”。論文通信作者為清華大學醫學院教授顏寧（Nieng Yan）博士。
在三種哺乳動物Hh同源物Sonic（Shh）、Desert（Dhh）和Indian（Ihh）中，Shh一直是功能和機制研究的原型。在大腸桿菌中表達和純化的人Shh的N-端結構域（ShhN, 氨基酸殘基24～197）能夠在膽固醇琥珀酸單酯（cholesteryl hemisuccinate, CHS）的存在下與去污劑溶解的Ptch1蛋白形成一種穩定的復合物。
顏寧課題組分別在3.9埃分辨率下和在3.6埃分辨率下解析出人Ptch1單獨時以及它與ShhN結合在一起時的低溫電鏡結構。他們識別出兩個相互作用的胞外結構域ECD1和ECD2，以及12個跨膜區段（TM1～12）。一旦ShhN結合，ECD1和ECD2向彼此移動，而且它們一起構成ShhN的?？课稽c。顏寧課題組對ShhN與Ptch1之間的詳細識別進行了分析和生化驗證。
在具有或不具有ShhN的Ptch1中觀察到兩個與CHS相一致的類固醇密度（steroid-shaped density）：一個在由這兩個胞外結構域包圍的口袋中，另一個在SSD的膜面向的腔中?；诮Y構的生化分析揭示出ShhN和Ptch1之間的類固醇依賴性相互作用。相比于野生型Ptch1，類固醇結合缺陷型Ptch1突變體的結構表現出顯著的構象重排。
總之，人Ptch1單獨時及其與ShhN結合在一起時的結構揭示出Ptch1和ShhN之間識別的分子基礎。在Ptch1中鑒定出兩個類固醇結合位點為在未來研究Hh信號建立了重要的框架，并對含有SSD蛋白的固醇感知提供了關鍵見解。
參考資料：
Xin Gong1,*,†, Hongwu Qian1,*,†, Pingping Cao et al. Structural basis for the recognition of Sonic Hedgehog by human Patched1. Science, 10 Aug 2018, 361(6402):eaas8935, doi:10.1126/science.aas8935.
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此文關鍵字：蛋白識別
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