PNGase F (Peptide-N-Glycosidase F)
肽-N-糖苷酶F
N-Peptide-N4-(acetyl-ß-glucosaminyl)-asparagine amidase; N-Glycosidase F
肽-N4-(乙酰基葡糖胺)-天冬酰胺酶；N-糖苷酶F
肽-N4-(乙酰基葡糖胺)-天冬酰胺酶；N-糖苷酶F
來源:腦膜膿毒性伊麗莎白菌（Elizabethkingia meningosepticum）
EC編號： 3.5.1.52
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Catalog Numbers
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Size
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酶活
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E-PNG01
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60 µl
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0.3 U
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E-PNG01-20
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20 µl
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0.1 U
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E-PNG01-200（E-PNG05）
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200 µl
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1.0 U
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推薦試劑，包含E-PNG01:
1小瓶： 5x 反應緩沖液 pH 7 - 400 µl
1小瓶： 變性溶液 - 200 µl 2% SDS/ 1 M β-巰基乙醇
1小瓶： 15% Triton X-100 - 200 µl
活力: 5 U/ml
比活力: ≥ 25 U/mg
分子量: 大約為35 kD.
較優pH: 7.5, 在 6-10范圍具備酶活性。
儲存: 比活力
一個單位的肽-N-糖苷酶F活力定義為，在37°C，pH 7.5時在1分鐘內從1微摩爾核糖核酸酶B上催化釋放N-鏈接寡糖所需酶的數量。通過SDS-PAGE監測裂解（裂解核糖核酸酶B遷移更快）。
配方:該酶溶于20mM Tris-HCl (pH 7.5)中，并經無菌過濾。
特異性
肽-N-糖苷酶F可將天冬酰胺鏈接（N-鏈接）寡糖從糖蛋白上裂解下來。肽-N-糖苷酶F使天冬酰胺脫氨基成為天冬氨酸，而寡糖部分則保持完整。
變性使裂解率增加到100倍。大多數天然蛋白質仍然可以完全N-去糖基化，但必須增加培養時間。肽-N-糖苷酶F在培養條件下，可保持活性至少72小時。
肽-N-糖苷酶F不會去除含有α-（1,3）鍵核心巖藻糖結構的寡糖，該寡糖通常在植物糖蛋白上常見的；為此，請使用肽N-糖苷酶A。
穩定性:
在室溫條件即使曝露幾天，也不會使活力下降。如果儲存得當，可至少穩定12個月。
質量和純度
肽-N-糖苷酶F的蛋白酶污染檢測過程如下： 將10μg變性BSA與2μl酶在37°C下培養24小時。SDS-PAGE a分析顯示處理后的BSA沒有退化跡象。
通過延長與相應的PNP糖蛋白一起培養的時間，可以確認外糖苷酶污染物是否存在。肽-N-糖苷酶F是從伊麗莎白（金桿菌或黃桿菌）腦膜敗血癥培養上清液中分離出來的。重要的污染物包括內切糖苷酶F，它使部分N-鏈接的寡糖在二乙酰殼二糖核心結構內發生裂解，留下N-乙酰氨基葡萄糖殘基連在天冬酰胺上。這些污染物通過色譜法，從肽-N-糖苷酶F試劑中去除。
使用指導
1. 將至多200µg糖蛋白加入一個Eppendorf離心管中。用去離子水定容到35 µli。
2. 將10 µl 5倍 反應緩沖液（pH7.5）和2.5 µl變性溶液，加熱到100°C保溫 5分鐘。
3. 冷卻。加入2.5 µl Triton X-100并混合。
注意：不加Triton X-100會導致肽-N-糖苷酶F活力下降3倍。
4. 往反應溶液中加2.0 µl肽-N-糖苷酶F。在37°C下培養3小時。 如省略了SDS或熱變性，那么培養時間應增加到至少24小時。 通過SDS-PAGE來監控裂解反應。
參考文獻：
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Elder, J.H. and S . Alexander. endo-b-N-Acetylglucosaminidase F: endoglycosidase from Flavobacterium meningosepticum that cleaves both high-mannose and complex glycoproteins. Proc Natl Acad Sci USA 79: 4540-4544 (1982)
Tarentino, A .L. , C.M. Gomez an d T.H . Plummer, Jr. Deglycosylation of asparagine-linked glycans by peptide:N-glycosidase F . Biochemistry 24: 4665-4671 (1985)
Tarentino A.L. and T.H. Plummer. Enzymatic deglycosylation of asparagine-linked glycans: purification, properties, and specificity of oligosaccharide-cleaving enzymes from Flavobacterium meningosepticum. Meth Enzymol 230:44-57 (1994)
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Taga, E. M., A. Waheed and R. L. Van Etten. Structural and chemical characterization of a homogeneous peptide N-glycosidase from almond. Biochemistry 23:815-22 (1984).