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2-AA 多糖標(biāo)記試劑盒

貨號(hào)：LT-KAA-A2
包裝：原裝進(jìn)口

英文名：2-AA (2-aminobenzoic acid) Glycan Labeling Kit
別名：多糖標(biāo)記試劑盒（2-氨基苯甲酸標(biāo)記）
品牌：Ludger

西寶生物提供Ludger 2-AA 多糖標(biāo)記試劑盒（2-AA Glycan Labeling Kit），貨號(hào)：LT-KAA-A2。

*西寶提示：我司所銷售的化學(xué)試劑、原料等所有產(chǎn)品（包括但不限于抗生素類、蛋白質(zhì)類、試劑盒類產(chǎn)品等）僅限用于科學(xué)研究用途，不得作用于人體。

訂購熱線：400-021-8158

產(chǎn)品詳情質(zhì)檢信息訂購列表

LudgerTag™ 2-AA（2-氨基苯甲酸）多糖標(biāo)記試劑盒（貨號(hào)：LT-KAA-A2）包含經(jīng)胺化還原反應(yīng)使染料結(jié)合在多糖未結(jié)合還原端基的試劑，使用2-氨基苯甲酸（2-AA）標(biāo)記未結(jié)合多糖。

應(yīng)用：用2-氨基苯甲酸（2-AA）標(biāo)記未結(jié)合多糖

染料性質(zhì)

分子量 137

熒光 λex（染料） = 320 nm, λex（多糖結(jié)合染料） = 360 nm，λem = 420 nm

*我們建議激發(fā)波長為360納米，以獲得大的檢測(cè)靈敏度

結(jié)構(gòu)

樣品數(shù)：通常每套標(biāo)記試劑較佳情況下可分析15個(gè)獨(dú)立樣品。

樣品量：每個(gè)樣品含25pmol到25nmol多糖。

適合檢測(cè)的樣品：帶有未結(jié)合還原末端的純化聚糖，都可以進(jìn)行標(biāo)記。

結(jié)構(gòu)完整性：未發(fā)現(xiàn)唾液酸、巖藻糖、硫酸鹽或磷酸鹽的損失（<2摩爾百分比）。

標(biāo)記效率：通常大于85%（取決于樣品）。

標(biāo)記選擇性：本質(zhì)上是化學(xué)計(jì)量標(biāo)記。

儲(chǔ)存：室溫下暗處儲(chǔ)存。遠(yuǎn)離熱源、避光和防潮。所供試劑至少可穩(wěn)定保存兩年。

運(yùn)輸：該產(chǎn)品可在室溫下運(yùn)輸。

處置：使用時(shí)涉及的玻璃或塑料器皿以及溶劑，應(yīng)確保不含糖化酶及外源性碳水化合物。在所有樣品處理時(shí)，使用無粉末手套，避免受到外源性碳水化合物的污染。標(biāo)記試劑設(shè)計(jì)的所有步驟都必須在干燥環(huán)境下操作，并使用干燥的玻璃和塑料器皿。一旦打開試劑瓶，應(yīng)立即使用。多余試劑根據(jù)當(dāng)?shù)匕踩?guī)則丟棄。

安全：僅供研究用。不得用于人體或藥用。請(qǐng)閱讀安全數(shù)據(jù)表（SDS）了解所有相關(guān)化學(xué)品。標(biāo)記試劑涉及的操作，都應(yīng)配備使用適當(dāng)?shù)膫€(gè)人安全保護(hù)裝置 - 眼鏡、耐化學(xué)性手套（如腈類手套），以及在實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)柜進(jìn)行操作。

試劑盒組成

每個(gè)標(biāo)記試劑盒包括1瓶以下試劑:

Cat.	# Item	Quantity
LT-2AA-01	2-AA染料 (2-氨基苯甲酸)	5 mg
LT-DMSO-01	二甲基亞砜 DMSO	350 μl
LT-ACETIC-01	冰醋酸	500 μL
LT-CYANOB-01	氰基硼氫化鈉(還原劑)	6 mg

所需的其他試劑和設(shè)備

加熱模塊、爐或相近功能的干熱器（不能使用水?。?，設(shè)定在65°C
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（例如Savant, Heto, 或其它）
反應(yīng)小瓶 (e.g. 聚丙烯微量離心瓶)
注：如果進(jìn)行樣品標(biāo)記后洗滌（參見樣品洗滌部分），則需要其它試劑。

標(biāo)記操作時(shí)間線

LudgerTag 標(biāo)記過程,加上可選樣品標(biāo)記后洗滌，通常需要4-5個(gè)小時(shí)：

過程	時(shí)間	總時(shí)間（小時(shí)）
樣品轉(zhuǎn)移到反應(yīng)瓶并干燥	30分鐘	0.5
配置并加入標(biāo)記試劑	15分鐘	0.75
樣品和試劑一起培養(yǎng)	3 小時(shí)	3.75
標(biāo)記后洗滌	1小時(shí)	4.75

還原性胺化

標(biāo)記反應(yīng)涉及一個(gè)兩步反應(yīng)過程。 (見圖1):

1.希夫堿生成

具有未結(jié)合還原末端的多糖，其末端在閉環(huán)（有環(huán)）和開環(huán)（無環(huán)）狀態(tài)之間處于平衡狀態(tài)。染料的伯胺對(duì)無環(huán)還原端基殘基的羰基碳進(jìn)行親核進(jìn)攻，形成部分穩(wěn)定的席夫堿。

2. 希夫堿還原

希夫堿亞胺基通過化學(xué)還原生成穩(wěn)定標(biāo)記的多糖。

圖1:通過還原性胺化反應(yīng)，用2-氨基苯甲酸標(biāo)記多糖

標(biāo)記操作概述

LudgerTag 多糖標(biāo)記試劑盒，用于熒光或發(fā)色標(biāo)記帶有為結(jié)合還原端基的多糖。在所中色譜和結(jié)構(gòu)序列分析中，經(jīng)標(biāo)記的多糖既可以進(jìn)行高靈敏度熒光檢測(cè)，也可以進(jìn)行紫外吸收監(jiān)測(cè)，包括使用LudgerSep液相色譜柱的色譜分析和使用外切糖苷酶的序列分析（參見參考1-5, 7)。

標(biāo)記過程概述如下：

1 多糖準(zhǔn)備

準(zhǔn)備多糖樣品，去除類似鹽和洗滌劑等可能干擾標(biāo)記過程的污染物。

2 多糖干燥

將樣品置于反應(yīng)小瓶中干燥。

3 標(biāo)記試劑準(zhǔn)備

將試劑盒中相關(guān)試劑混合制備新鮮的染料標(biāo)記溶液。

4 將標(biāo)記試劑加入多糖中

將小量的標(biāo)記溶液加入每一份多糖樣品中

5 培養(yǎng)

培養(yǎng)樣品使標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行下去。

6 標(biāo)記后洗滌

培養(yǎng)完成后，如有必要（根據(jù)后續(xù)分析過程而定），直接進(jìn)入洗滌流程以去除過量的標(biāo)記試劑。.

7 經(jīng)標(biāo)記的多糖儲(chǔ)存或者分析

經(jīng)標(biāo)記的多糖樣品現(xiàn)在可以用于分析了。

樣品準(zhǔn)備

要進(jìn)行標(biāo)記的多糖樣品，無論是純化的或是多糖混合物，必須包含未結(jié)合的還原端基，顆粒狀且不含無機(jī)鹽，并溶于易揮發(fā)的溶劑體系中（建議是純水）。

下列物質(zhì)可能干擾標(biāo)記反應(yīng)，必須在進(jìn)行LudgerTag™ 標(biāo)記之前，事先從多糖樣品中去除：

不揮發(fā)溶劑
不揮發(fā)鹽，尤其是過渡金屬離子
洗滌劑
染料和染色劑，例如考馬斯藍(lán)

Ludger提供了一系列LudgerClean™試劑盒，用于在Ludgertag™標(biāo)記之前洗滌多糖樣品。這些內(nèi)容在LudgerClean多糖洗滌指南[參考6]中有詳細(xì)說明。

標(biāo)準(zhǔn)樣品制備概述如下：

1 多糖純化

如有必要，從樣品中按照多糖洗滌指南[參考6]中所述去除非碳水化合物污染物。

2 將樣品轉(zhuǎn)移至反應(yīng)小瓶中

從典型糖蛋白中獲得的多糖，樣品量應(yīng)在100個(gè)皮摩爾-50納米摩爾的范圍內(nèi)。單一的純多糖，即使僅有5皮摩爾的量，也可以被標(biāo)記，并在之后高效液相色譜分析中檢測(cè)出。適用的反應(yīng)小瓶，包括小型聚丙烯微離心管和可用于PCR操作的試管。

3 樣品干燥

理論上，應(yīng)使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥樣品。如果條件不允許，可以小心使用冷凍干燥（尤其要確保在小瓶的底部的樣品，凍干成小而致密的物質(zhì)）。不要將樣品置于高溫（>28℃）或極端pH環(huán)境下，因?yàn)檫@樣會(huì)導(dǎo)致唾液酸在酸催化下耗損（高溫、強(qiáng)酸），或多糖還原端的異構(gòu)反應(yīng)（強(qiáng)堿）。

標(biāo)記試劑準(zhǔn)備

按如下過程制備新鮮標(biāo)記試劑：

4 制備DMSO-醋酸混合液

150μl冰醋酸加入盛有DMSO的小瓶中，并用移液器抽吸混合。

冰醋酸和DMSO的貨號(hào)分別為LT-ACETIC-01和 LT-DMSO-01。

小心敲擊安瓿瓶以震落附著安瓿上半部的內(nèi)容物，然后小心打開安瓿瓶。

如果DMSO凍成固體，在烘箱或加熱快上在30-65℃之間緩慢加熱小瓶（在啟封前）。

5 加入染料

將100μl DMSO-醋酸混合液加入LudgerTag™ 2-AA (2-氨基苯甲酸) 染料小瓶中，混合直至染料全部溶解。

染料貨號(hào)為LT-2AA-01。

6 加入還原劑

將溶解的染料加入盛有LudgerTag™ 氰基硼氫化鈉 (還原劑) 的小瓶中，使用移液器抽吸混合直至還原劑全部溶解形成最終的標(biāo)記試劑。

氰基硼氫化鈉還原劑的貨號(hào)是LT-CYANOB-01。

如果還原劑難以溶解，那么在65℃的恒溫培養(yǎng)箱中，或者加熱塊上，輕緩地加熱至多4分鐘。如還原劑仍未全溶，補(bǔ)加10μl純水并混合均勻。

標(biāo)記試劑應(yīng)防潮，并在配置60分鐘內(nèi)使用。

標(biāo)記反應(yīng)

7 將標(biāo)記試劑加入樣品

將5μl標(biāo)記試劑加入到每一份經(jīng)干燥的多糖樣品中，蓋上離心管，徹底混合，然后輕輕敲擊以確保標(biāo)記溶液位于小瓶的底部。

8 培養(yǎng)

將反應(yīng)小瓶放在65℃的加熱塊、砂浴或烘箱中，培養(yǎng)3小時(shí)。

培養(yǎng)必須在干燥的環(huán)境下進(jìn)行。請(qǐng)使用培養(yǎng)箱或干燥塊，請(qǐng)務(wù)必不要使用水浴。

樣品必須全部溶解在標(biāo)記溶液中，才能有效進(jìn)行標(biāo)記。為了促進(jìn)全部溶解，樣品可在培養(yǎng)溫度達(dá)到65℃后渦旋混合30分鐘，然后繼續(xù)培養(yǎng)。

在大多數(shù)情況下，培養(yǎng)時(shí)間可以縮短至2小時(shí)或延長至4小時(shí)，而不會(huì)顯著改變標(biāo)記反應(yīng)結(jié)果。

9 離心并冷卻

培養(yǎng)結(jié)束后取出樣品，短暫離心微量試管，并讓其全部冷卻至室溫。

LudgerClean™ S 標(biāo)記后樣品洗滌

對(duì)于特定的應(yīng)用 - 例如后續(xù)的HPLC分析，標(biāo)記后的樣品洗滌(去除多余的染料和其它標(biāo)記試劑) 是必不可少的。使用LudgerClean™ S 小柱 (貨號(hào) LC-S-Ax, 此處x代表試劑盒中小柱的數(shù)量)按試劑盒所附標(biāo)準(zhǔn)操作程序可以完成樣品洗滌。

對(duì)于過量標(biāo)記試劑不會(huì)影響后續(xù)樣品分析的應(yīng)用而言，樣品標(biāo)記后洗滌并非必需。這些分析手段包括碳水化合物電泳，游離染料會(huì)從標(biāo)記多糖條帶處分離開。

LudgerTag™ 2AA標(biāo)記多糖的分析

LudgerTag™ 2-AA標(biāo)記多糖可通過一系列分析方法進(jìn)行研究，包括HPLC，凝膠電泳和質(zhì)譜。這些會(huì)在參考資料8里詳細(xì)敘述，在下文也有概述。

高壓液相色譜分析

LudgerTag™ 2-AA標(biāo)記多糖混合物可以通過一系列HPLC（高壓液相色譜）方法進(jìn)行分離和分析，也包括LudgerSep HPLC:

分析類型	柱子	貨號(hào)
帶電荷和中性多糖的分離	LudgerSep™ C	LS-C-01
帶電荷和中性多糖的剖面分析	LudgerSep™ N	LS-N-01
中性多糖的分離	LudgerSep™ R	LS-R-01

上述多糖分析柱的使用在參考4和參考8里有概述。

對(duì)于從復(fù)雜多糖混合物中純化和分析LudgerTag?標(biāo)記寡糖而言，LudgerSep N柱是很有效的分析工具。

關(guān)于您的特殊應(yīng)用，請(qǐng)聯(lián)系我們獲取建議。

酶法分析

高純度，測(cè)序級(jí)酶（例如外切糖苷酶）,適合N-和O-鏈接LudgerTag™ 標(biāo)記多糖的結(jié)構(gòu)分析，許多公司有市售產(chǎn)品。

選擇糖苷酶時(shí)，尤其應(yīng)注意選擇配方與您專屬應(yīng)用匹配的產(chǎn)品。例如，部分酶和緩沖液擁有會(huì)干擾特定分析手段的組份。在選則您工作所需的酶和反應(yīng)條件時(shí)，請(qǐng)致電我們獲取指導(dǎo)。

質(zhì)譜和電泳

LudgerTag™ 標(biāo)記多糖也可以用質(zhì)譜、電泳和其它光譜分析手段進(jìn)行分析。如果您想確定合適的分析條件，請(qǐng)來電咨詢。

參考文獻(xiàn)及相關(guān)文獻(xiàn)

1 Bigge, J.C.; Patel, T.P; Bruce, J.A.; Goulding, P.N.; Charles, S.M; Parekh, R.B. (1995) 'Non-selective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-aminobenzamide and anthranilic acid'. Analytical Biochemistry 230: 229-238

2 Guile, G.R.; Rudd, P.M.; Wing, D.R.; Prime, S.B.; Dwek, R.A. (1996) 'A rapid and high-resolution high-performance liquid chromatographic method for separating glycan mixtures and analyzing oligosaccharide profiles'. Analytical Biochemistry 240: 210-226

3 Townsend, R.R.; Lipniunas, P.H.; Bigge, C.; Ventom, A.; Parekh, R. (1996) 'Multimode high-performance liquid chromatography of fluorescently labeled oligosaccharides from glycoproteins'.Analytical Biochemistry 239: 200-207

4 LudgerSep High Resolution HPLC Carbohydrate Profiling Guide (Cat # LS-GUIDE-01)

5 Ludger Enzyme Selection Guide (Cat # EZ-GUIDE-01)

6 LudgerClean Glycan Cleanup Guide (Cat # LC-GUIDE-01)

7 Hardy, M.R. (1997)‘Glycan labeling with the fluorophores 2-aminobenzamide and anthranilic acid’in ‘Techniques in Glycobiology’, edited by Townsend, R.R and Hotchkiss, A.T.. Marcel Dekker Inc, New York .

8 Ludger Technical Note # TN-AA-01: Analysis of 2-AA (2-aminobenzoic acid) labeled glycans

故障排除

Ludgertag™標(biāo)記過程是一種有效、可靠的方法。如果出現(xiàn)問題，通常可以毫無毫不費(fèi)力地予以糾正。以下是有可能出現(xiàn)的問題、可能的原因和解決方案。

染料結(jié)合率低 / 標(biāo)記收率低

標(biāo)記溫度不正確

請(qǐng)確保烘箱或加熱塊預(yù)設(shè)與培養(yǎng)溫度相稱，并確保反應(yīng)管在標(biāo)記時(shí)始終處于該溫度下。

樣品未全部溶解

多糖必須全部溶解在標(biāo)記混合溶液中，標(biāo)記效率才能放大化。

請(qǐng)確保在培養(yǎng)操作之前，樣品與標(biāo)記試劑全部混合均勻。作為預(yù)防措施，在培養(yǎng)開始后，繼續(xù)仔細(xì)攪拌樣品15分鐘。

樣品中含有干擾標(biāo)記的污染物。

在標(biāo)記之前，請(qǐng)確認(rèn)多糖得到足夠純化（參見操作步驟1和 LudgerClean™ 多糖洗滌指南）

標(biāo)記溶液無效。

請(qǐng)務(wù)必在使用前即刻配置標(biāo)記溶液 - 試劑在混合后的幾小時(shí)內(nèi)即會(huì)失活。

啟動(dòng)時(shí)多糖較原先預(yù)估的要少

多糖不含未結(jié)合的還原基團(tuán)。

2-AA染料通過未結(jié)合的還原端的醛基與多糖結(jié)合。糖醇和還原端基已經(jīng)結(jié)合的多糖（例如糖肽，糖脂和已標(biāo)記多糖）不含未結(jié)合還原端基，因此無法和染料結(jié)合。

在標(biāo)記后洗滌時(shí)多糖損耗。

請(qǐng)確認(rèn)已經(jīng)按照洗滌規(guī)程去除多余標(biāo)記試劑，且洗滌試劑正確配制。

標(biāo)記樣品中含有帶熒光的非碳水化合物

原始的多糖中含有醛穩(wěn)定污染物。

請(qǐng)確認(rèn)多糖在標(biāo)記前已經(jīng)足夠純化（參見操作步驟1和LudgerClean多糖洗滌指南)。

標(biāo)記后洗滌步驟未正常工作

請(qǐng)確認(rèn)已經(jīng)按照洗滌規(guī)程去除多余標(biāo)記試劑，且洗滌試劑正確配制。

較小分子量多糖選擇性損耗

洗滌小柱未正確填充

請(qǐng)確保小柱已經(jīng)正確充填，樣品上盤時(shí)，柱床已經(jīng)用乙腈浸潤。

標(biāo)記后洗滌時(shí)是否使用了不當(dāng)清洗劑。

請(qǐng)確保清洗劑正確配制。

較大分子量多糖選擇性損耗

樣品未全部溶解

多糖必須全部溶解于標(biāo)記混合物中以獲得較大標(biāo)記效率。較大的多糖較小分子糖更難溶于標(biāo)記混合物中。請(qǐng)確保樣品在培養(yǎng)前與標(biāo)記試劑混合均勻，可以在培養(yǎng)開始后再小心混合樣品15分鐘，以作為預(yù)防措施。

多糖去唾液酸化

樣品在高溫下水溶液中呈酸性。

避免唾液酸化多糖樣品溶液長時(shí)間處于酸性和高溫環(huán)境下。注意還原胺化反應(yīng)是在無水條件下進(jìn)行的，在此條件下唾液酸的損失較小。

通常，樣品保存在5-8.5的溶液中，避免暴露在30℃以上的溫度下。樣品溶于pH緩沖溶液（pH介于5和8.5之間），即使在高于30℃的溫度下，也往往能夠抵抗酸催化的去唾液酸反應(yīng)。即使這樣，也要謹(jǐn)慎行事，盡可能保持樣品冷卻。

樣品標(biāo)記后沒有正確洗滌

確保樣品在還原胺化反應(yīng)后立即進(jìn)行標(biāo)記后洗滌，且標(biāo)記后的干燥和洗滌應(yīng)金肯能快地進(jìn)行。

未經(jīng)干燥和隨后洗滌的標(biāo)記樣品容易發(fā)生酸催化去唾液酸反應(yīng)。


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