優點

（1）操作簡單，可在幾分鐘內快速、準確地檢測含量，真實反映病情進展和評估治療效果，對于疾病的早期診斷和治療具有重要的臨床意義；
（2）不易受人為操作和外界因素干擾，檢測穩定性和重復性都很好；
（3）能利用普通的生化分析儀進行檢測，容易實現自動化，可在各級基層醫療機構普及和應用。

影響共價偶聯的因素

A活性基團和偶聯試劑

1、配體 因為活性和結合動力學是高度依賴于固定化分子的取向，故可用于偶聯和修飾的活性基團必須慎重考慮。

2、微球 生物分子可通過各種表面化學試劑偶聯到聚合物或硅基微球上。可用的表面官能團包括：聚合-羧基和氨基（常用的）以及羥基、肼基和氯甲基；和硅-醇硅基、羧基。

部分產品列表 (更多產品請見http://www.seebio.cn/Article/1404_1.html)

3、交聯劑 交聯劑可用于激活含水環境中表現出低反應活性的基團（碳二亞胺與羧基結合），或者加入到對彼此沒有反應的基團中（如氨基與氨基結合）
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B微球組成

微球的特定組成將決定其特性，如如疏水性或親水性，正電荷或負電荷，表面電荷密度等，這些特點都會對其承載能力有一定影響。也就是說，生物分子怎么有效地進入化學基團附近，以便可能發生偶聯。他們還將影響非特異性結合特性，但非特異性結合可能與阻斷劑、緩沖液及檢測的條件（如：樣品稀釋）等有關。

C試劑的質量

試劑的質量對成功的偶聯是至關重要的，并影響包被微球的性能。遵從制造商的指引

用于試劑調制，使用，存儲，和過期應觀察到保證活性和穩定性，并且采取措施防止污染。

D、試劑的濃度

確定不同試劑的適當濃度，比如配體或交聯劑，對控制表面密度很重要。使用太少會導致包被不是較理想且活性低。使用太多會導致微球“過載”（空間位阻效應，減少活性）或者單純地浪費昂貴的試劑。

E、緩沖液

1、總論

緩沖液的選擇和具體方案（配體和反應基團）有關。在選擇緩沖液時，考慮到與配體的相容性。此外，還要考慮到緩沖液中不能包含參與或干擾反應的化合物。比如，磷酸鹽和醋酸鹽緩沖液會降低碳二亞胺的反應活性，因此不建議在羧基微球偶聯中作為激活緩沖液使用。在這種情況下，一種流行的替代是使用MES。又如，在與胺活性化學物質作用時，應避免含有游離胺的緩沖液（Tris或甘氨酸）。

2、配方中常用的緩沖液

a、磷酸鹽緩沖液（PBS）pH7.4

i.磷酸氫二鉀:1.82g/L(MW174.2)

ii.磷酸二氫鈉:0.22g/L(MW120.0)

iii.氯化鈉:8.76g/L(MW58.4)

用去離子水最終定容至1L，用1N鹽酸或1N氫氧化鈉調節pH至7.4.

b、硼酸鹽緩沖液pH8.5

i.硼酸,H3BO3:12.4g/L(MW61.8)

ii.硼氫化鈉:19.1g/L(MW381.4)

加入50mL硼酸溶液至14.5mL硼氫化鈉溶液中,用去離子水最終定容至200mL。用3M的氫氧化鈉 調節pH至8.5.

c、醋酸鹽緩沖液pH3.6~5.6

i.0.1M醋酸:(5.8mL制備1000mL)

ii.0.1M醋酸鈉:8.2g/L(無水,MW82.0)

按如下所示比例混合醋酸和醋酸鈉溶液，用去離子水最終定容至100mL。用1N鹽酸或 1N氫氧化鈉調節pH。

d、檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液pH2.6~7.0

i.0.1M檸檬酸:19.2g/L(MW192.1)

ii.0.2M磷酸氫二鈉:35.6g/L(二水,MW178.0)
按如下所示比例混合檸檬酸和磷酸氫二鈉溶液，用去離子水最終定容至100mL。用1N 鹽酸或1N氫氧化鈉調節pH。

e、碳酸鹽-碳酸氫鈉緩沖液pH9.2-10.4

i.0.1M碳酸鈉:10.6g/L(無水,MW106.0)

ii.0.1M碳酸氫鈉:8.4g/L(MW84.0)

按如下所示比例混合碳酸鈉和碳酸氫鈉溶液，用去離子水最終定容至200mL。用1N 鹽酸或1N氫氧化鈉調節pH。

f、MES緩沖液pH5.7~7.2

溶解21.3gMES一水物至約900mL的純水中。用1N鹽酸或1N氫氧化鈉滴定至所需的pH并用純水定容至1000mL。

 

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*膠乳溶液一般常用低濃度的Good's緩沖液儲存。（更多Good's緩沖液請見http://www.seebio.cn/Article/goods%20buffer_1.html）

 

3、抗菌劑

低濃度(0.05%-0.1%)的抗菌劑,例如疊氮鈉或硫柳汞，經常被加入到儲存緩沖液中，特別是長期儲存的時候。抗菌劑的選擇要謹慎，因為他們可能會展現出不同的穩定性，涉及到特殊處理事項等。例如，疊氮鈉與鉛、銅管道反應會生成易爆的疊氮金屬化合物，因此，在清理材料時，要用大量的水沖洗管道并防止疊氮化物積累。

F、阻斷劑

阻斷劑通常在偶聯反應后用于包被微球，可以使微球與非目標分子的非特異性結合最小化。阻斷劑應謹慎選擇，以確保它可以有效地減少非特異性相互作用。某些阻斷劑可能會干擾檢測，或實際上有助于非特異性結合。對阻斷劑的濃度進行評估，確保有足夠的阻擋而沒有明顯的活性損失。阻斷劑通常以不同的量加入到儲存緩沖液中，標準濃度為0.05~0.1%中的任意值。在一個獨立的孵育中，為了飽和微球的暴露表面，建議在儲存前用更高濃度的阻斷劑（1%）。以下是一些常用的阻斷劑：

a.BSA(牛血清白蛋白）：經常單獨使用，但是可以和其他的阻斷劑復合使用，常用的表面活性劑。

b.酪蛋白：一種牛奶基質的蛋白質，含有生物素原，在工作系統涉及生物素時應避免使用以防止干擾。

c.Pepticase（酪蛋白酶解產物）：酪蛋白的酶促衍生物，當工作系統涉及生物素時同樣應該避免。

d.非離子表面活性劑：吐溫20和Triton™X-100是典型的。當與另一種阻斷劑使用時，一個常用的比例為1％阻滯劑;0.05％的表面活性劑。

e.不相關的“IgG”：經常在標記特性IgG到微球上時使用。例如：如果偶聯小鼠IgG，兔（或任何非交聯反應的IgG）可以用作阻斷劑被吸附。

f.FSG（魚皮明膠）：純明膠或明膠水解產物也可使用。

g.PEG（聚乙二醇）：多功能的阻斷劑，可提供不同的分子量、結構和負載。

h.血清：非交聯反應血清，如馬血清或魚血清，在與各類抗體的交聯反應中都有很強的惰性。

i.商業阻滯劑：許多公司提供制劑，其是各種分子量的兩種或更多種單阻斷物質的復合，并且其可以有效地在寬范圍的條件下使用。這些以不同的商品名稱出售，而大多數化學廠商將提供多種。

阻斷劑的品種還有許多，我們建議嘗試各種組合和濃度。

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G、微球的處理

微球的處理對偶聯過程的結果有著顯著的影響。研究人員應該先考慮微球的清洗過程，這會影響偶聯的效率，微球的損失等。在過程控制中應當對其的單分散性進行監控，如果觀察到凝集則需要處理。

H、其他

還有其他參數可以被評估，包括培養時間和溫度，試劑添加的順序和速度等。

 

膠乳微球使用中常見問題及解答

問題：如何選擇微球粒徑？

回答：一般選擇粒徑小的膠乳微球，則需要的抗體量就多，精密度和線性相對較好，而選擇粒徑大的膠乳微球性，則所需抗體少，精密度和線性相對較差，相對于小球，大球的靈敏度較好。

 

問題：膠乳的自凝現象如何控制和避免？

回答：膠乳自凝與許多因素有關，如高電解質濃度、表面價電荷被中和、或置于某些不利環境如冷凍時。如果電解質濃度升高到某一水平，使得表面的價負荷被掩蔽，膠乳微球之間發生接觸，于是便產生凝集，故高離子強度的緩沖溶液不應使用，緩沖溶液的的濃度不要超過50mM，但有些CML膠乳微球具有高電荷密度，則也能夠耐受較高的離子強度。對負電荷膠乳微球，不能使用陽電荷的緩沖溶液如Tris緩沖溶液，因為能使電荷中和而凝集。在長期貯藏時，懸浮介質的pH值應至少保持在比膠乳微球表面基團的pKa值高1-2pH單位。高濃度的膠乳微球容易促使膠體不穩定，故膠乳微球的濃度盡量以低濃度為宜，膠乳微球也不能受冷凍，否則會凝集。

 

問題：微球與抗體偶聯應選用一步法還是二步法？

回答：一步法是將微球、抗體、偶聯劑一起加入到體系中進行反應，更適用于小分子的偶聯，比如：類固醇、半抗原。

 

問題：微球與抗體偶聯后，當時沒發現有凝集，但隔夜后發現有凝集，這是什么原因？如何控制和避免？

回答：這種情況一般是偶聯效率低的原因。當體系中蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交聯后還空出許多反應基團時，這些基團又可以與相連微球上的蛋白反應，結果是把球又拉在一起了，所以有聚集。可以加一些阻斷劑解決。

 

問題：膠乳溶液用什么緩沖液多大離子強度保存穩定性較好？

回答：一般常用的是低濃度的Goods緩沖液，如MOPSO、MES、HEPES等緩沖液，濃度在25-50mmol/L。