是否還記得小西家推出的護(hù)膚成分大咖"甘油葡萄糖苷 -- 你值得擁有"，參與這位"大咖甘油葡萄糖苷"合成的重要糖苷水解酶 -- 蔗糖磷酸化酶，也是生來自帶光芒。

糖基化作用能賦予天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性，改善化合物水溶性、穩(wěn)定性、生物利用度等性質(zhì)，所得產(chǎn)物能廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及個人護(hù)理等領(lǐng)域^[2]。目前有機(jī)小分子化合物的糖基化方法包括化學(xué)法和生物酶法。但化學(xué)法存在許多缺點(diǎn)，如需要昂貴的或有毒的催化劑、副產(chǎn)物多、收率低、合成步驟復(fù)雜^[3-4]等。而生物酶法反應(yīng)條件溫和，高效、綠色，反應(yīng)產(chǎn)生的廢料比化學(xué)法低5倍，時空產(chǎn)量高15倍^[5]。這種利用酶催化合成糖苷類化合物的方法目前很受歡迎。

目前應(yīng)用的糖基化反應(yīng)生物酶有兩種糖基轉(zhuǎn)移酶類(Glycosyltransferases，GTs)和糖苷水解酶類(Glycoside hydrolases，GHs)^[6]，相比于糖基轉(zhuǎn)移酶類，糖苷水解酶類在大規(guī)模催化中具有來源豐富、成本低的優(yōu)勢。蔗糖磷酸化酶（SPase）是GHs眾多出色的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶之一，SPase因其糖基化活性和廣泛的受體底物特異性，能將Suc的葡萄糖基轉(zhuǎn)移至多種受體化合物，使得SPase在糖基化應(yīng)用中比同類成員葡聚糖蔗糖酶和淀粉蔗糖酶表現(xiàn)更為突出，尤其是對非碳水化合物的糖基化活性使其逐漸成為酶工程研究的熱點(diǎn)^[7]。

蔗糖磷酸化酶由Kagan等^[8]在腸膜明串珠菌中發(fā)現(xiàn)，隨后在多種微生物中發(fā)現(xiàn)。SPase主要分布在細(xì)菌中，在植物細(xì)胞中僅有少量分布。

目前報(bào)道的SPase的來源菌株主要有四種^[9]：腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)^[10]、變異鏈球菌(Streptococcus mutans)、雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.)、嗜糖假單胞菌(Pseudomonas saccharophila)

蔗糖磷酸化酶約有500個氨基酸，分子量在50-60 kD之間。不同來源的SPase有其獨(dú)特的蛋白結(jié)構(gòu)和底物特異性，來源于腸膜明串珠菌和變形鏈球菌的蔗糖磷酸化酶(LmSP、SmSP)，是一種單體蛋白，而來自青春雙歧桿菌和嗜糖假單胞菌的SPase是一類二聚體。2004年，來源于青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶(BaSP)的晶體結(jié)構(gòu)(PDB 2gdv)被解析。如圖 1所示，BaSP的晶體結(jié)構(gòu)由4部分組成：結(jié)構(gòu)域A、B、B'、C。結(jié)構(gòu)域A包含一個GH13家族所共有的結(jié)構(gòu) -- (β/α) 8 桶，以及酶的活性位點(diǎn)；結(jié)構(gòu)域B由2個反向平行的β-折疊和2個短的α-螺旋組成；結(jié)構(gòu)域B'包括一長一短α-螺旋，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)減小了底物通道的大小，不利于低聚糖的結(jié)合；結(jié)構(gòu)域C由一個5鏈反向平行的β-折疊組成，雖然所有GH13家族的酶都含有此結(jié)構(gòu)域，但僅在蔗糖磷酸化酶中存在折疊結(jié)構(gòu)^[1]。

蔗糖磷酸化酶與GH13家族的其他酶一樣，在反應(yīng)時遵循雙重置換機(jī)制。2個羧基氨基酸(在BaSP中為Asp192和Glu232，對應(yīng)于LmSP中的Asp196和Glu237)在雙重置換機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，而且這2個催化殘基完全保守。Asp192 (催化親核試劑)攻擊異頭碳，同時Glu232 (一般酸/堿催化劑)將糖苷鍵的氧質(zhì)子化，隨后形成共價糖基酶中間體和釋放果糖。如圖 2所示，在受體位點(diǎn)發(fā)生構(gòu)象變化后，中間體可與不同的受體底物(水、無機(jī)磷酸、糖等)反應(yīng)，釋放出糖苷產(chǎn)物。值得注意地是，水解作為副反應(yīng)總是存在^[1]。

SPase催化的反應(yīng)圖

注：SPase與不同受體的反應(yīng)，H 2 O：水解反應(yīng)；Pi：磷酸解反應(yīng)；糖：轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)

近年來研究者利用酶的晶體結(jié)構(gòu)和定點(diǎn)突變等方法詳細(xì)闡釋了酶的反應(yīng)機(jī)制^[11]，利用相關(guān)位點(diǎn)定點(diǎn)突變研究證實(shí)了SPase的活性中心是結(jié)構(gòu)域A中的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)(Asp¹⁹²：催化親核試劑；Asp²⁹⁰：過渡態(tài)穩(wěn)定劑、Glu²³²：酸/堿催化劑) (圖3)，其在序列和結(jié)構(gòu)上都具有保守性^[12-14]。

SPase是一種很有潛力的酶，主要用于合成低聚糖和糖苷類產(chǎn)物，具有很大的商業(yè)價值^[1]。

低聚糖是一種新型功能型糖原，廣泛應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥和飼料添加劑等領(lǐng)域，具有多種功能生物學(xué)活性。目前，用于低聚糖合成的磷酸化酶主要有3類：蔗糖磷酸化酶、麥芽糖磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶，均屬葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。用于合成低聚糖的原料，如淀粉類、蔗糖、乳糖等，來源豐富且價格低廉。

曲二糖具有益生元及抑制α-葡萄糖苷酶的活性等作用，其可以通過SPase催化，以廉價的葡萄糖和蔗糖為底物合成，具有廣泛的應(yīng)用前景^[15]。SPase可以催化蔗糖和D-半乳糖合成蜜二糖，而蜜二糖可作為合成更高聚合度的糖的前體并對減輕過敏性皮炎癥狀有益^[16]。

此外，蔗糖磷酸化酶與其他酶一起反應(yīng)也可以生成低聚糖。將來自Bifidobacterium longum的蔗糖磷酸化酶(BlSP)、來自Cellulomonas uda的纖維二糖磷酸化酶(CuCbP)及來自Clostridium cellulosi的纖維糊精磷酸化酶(CcCdP)混合，以蔗糖和葡萄糖為底物，可以合成短鏈纖維低聚糖^[17]。一鍋多酶系統(tǒng)的開發(fā)，實(shí)現(xiàn)了在一個罐中進(jìn)行復(fù)雜的多步化學(xué)轉(zhuǎn)化，可以合成低聚糖、多糖和糖綴合物等；而且無需分離反應(yīng)中間體，簡化了下游分離的步驟，在工業(yè)應(yīng)用上引起了極大的關(guān)注^[18-19]。

3.2.1 α-熊果苷 

熊果苷是一種有效的皮膚美白劑，廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)^[20]。此外，熊果苷還具有抗氧化、抗菌活性及利尿特性，如今已用于治療炎癥、糖尿病、腎結(jié)石等病癥^[21-22]。熊果苷可分為α-熊果苷和β-熊果苷2類，在美白效果、水溶性和穩(wěn)定性方面α-熊果苷要優(yōu)于β-熊果苷^[23]，因此合成α-熊果苷越來越受到人們的關(guān)注。

目前，α-熊果苷的合成主要有3種方式，即化學(xué)合成、酶法合成及微生物合成。酶催化轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)是當(dāng)前生產(chǎn)熊果苷的主要方式，表1列出了用于生產(chǎn)熊果苷的幾種酶的相關(guān)信息，可以看出利用蔗糖磷酸化酶合成的產(chǎn)量明顯增加。

酶 Enzymes	反應(yīng)條件 Reaction conditions	產(chǎn)量 Yield	參考文獻(xiàn) References
LmSP	40 g/L hydroquinone, sucrose: hydroquinone=5:1, pH 7.0, 30 ℃, 24 h	98.00 g/L	[24]
SmSPI336L	Whole cell transformation	110.30 g/L	[25]
Amylosucrase	20 mmol/L sucrose, 5?mmol/L hydroquinone, pH 7.0, 40 ℃	44.70%	[26]
XcAS	1 mol/L sucrose, 200 mmol/L hydroquinone	53.86 g/L	[27]
Dextransucrase	215 mmol/L sucrose, 450 mmol/L hydroquinone	544.00 mg/L	[28]

GG在化妝品、食品等商業(yè)上的廣泛應(yīng)用，促進(jìn)了其合成方法的發(fā)展。GG可分為1-甘油葡萄糖苷和2-甘油葡萄糖苷，其中2-甘油葡萄糖苷又稱為αGG^[29]。由于αGG的保濕效果優(yōu)于1-甘油葡萄糖苷，因此目前的研究主要集中于合成αGG。早期報(bào)道過利用化學(xué)法合成αGG，但由于化學(xué)法合成效率低、提取復(fù)雜、生物合成法成本高，因此酶法合成是目前最常用的方法^[30]。酶法合成αGG如表 2所示，均由蔗糖磷酸化酶參與合成。

酶 Enzymes	反應(yīng)條件 Reaction conditions	產(chǎn)量 Yield	參考文獻(xiàn) References
LmSP	0.8 mol/L sucrose, 2.0 mol/L glycerol, 20 U/mL SPase, pH 7.0, 30 ℃	63.0%	[31]
LmSP	Immobilized Z basic2 -SPase	85.0%	[32]
LmSP	Whole-cell catalyst, 1 mol/L sucrose, 2.5 mol/L glycerol, pH 7.0, 30 ℃	189.3 g/L	[33]
BaSP/L341W	200 g/L sucrose, 200 g/L glycerol, 30 ℃	86.0 g/L	[29]

除了合成熊果苷和GG外，SPase還可以將葡萄糖基轉(zhuǎn)移至羧基化合物或多酚類化合物中，用于改善這些化合物的一些特性，增強(qiáng)它們作為食品和化妝品添加劑的有效性^[34]。

L-抗壞血酸(L-Ascorbic Acid，L-AA)，又稱維生素C，具有抗氧化、抗自由基、抑制酪氨酸酶的形成等功能，從而達(dá)到美白、淡斑的效果，可作為化妝品的有效成分。然而由于L-AA的高抗氧化活性，其在自然狀態(tài)下不穩(wěn)定，限制了L-AA在化妝品和食品工業(yè)的廣泛應(yīng)用^[35]。利用來自Bifidobacterium longum的SPase (BlSP)催化蔗糖和L-AA合成L-抗壞血酸2-O-α-D-葡萄糖苷(L-Ascorbic Acid 2-Glucoside，AA-2G)，該化合物是L-AA的穩(wěn)定形式^[36]。

曲酸(5-羥基-2-羥甲基-γ-吡喃酮)是由許多曲霉和青霉菌產(chǎn)生的真菌代謝產(chǎn)物。作為一種美白產(chǎn)品，曲酸能夠抑制酪氨酸酶的活性，減少黑色素的產(chǎn)生。但是從絲狀真菌中提取出的曲酸具有一定毒性。利用SPase對曲酸進(jìn)行糖基化后，其產(chǎn)物不僅能抑制酪氨酸酶的活性，還有更好的水溶性、穩(wěn)定性^[37]。

植物多酚類物質(zhì)，如芪類化合物、白藜蘆醇、黃酮類化合物，由于其抗菌和抗腫瘤等活性在醫(yī)藥領(lǐng)域有很大的用處。白藜蘆醇是天然存在于葡萄、虎杖中的芪類化合物，作為植物抗毒素用于防御傷害和微生物感染^[38-39]。近年來的臨床試驗(yàn)證明，白藜蘆醇可用于治療糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并作為食品和化妝品成分用于商業(yè)上^[40]。然而天然白藜蘆醇水溶性較差，生物利用度較低，導(dǎo)致其在工業(yè)上應(yīng)用的效果大大下降^[41]。將白藜蘆醇糖基化是改善白藜蘆醇水溶性或藥物特性的一般策略^[42]，Kraus等對BaSP進(jìn)行合理地誘變后，得到突變體BaSP Q345F；隨后，利用該突變體對白藜蘆醇進(jìn)行高效糖基化，改善了白藜蘆醇的水溶性和生物利用度^[43]。

目前，已經(jīng)商業(yè)化的產(chǎn)品有α-熊果苷、αGG及曲二糖等。α-熊果苷從2002年起已作為化妝品的美白添加劑在許多品牌中使用(如：日本資生堂、蝶翠詩)，其價格約為4000-8000元/kg。商業(yè)上將αGG稱為格萊可因(Glycoin)，由于其生產(chǎn)過程價格昂貴且沒有較好的分離方法，導(dǎo)致其價格昂貴--含量50%的αGG價格約為3000元/kg。曲二糖在中國的研究還不多，但已作為試劑及一些藥物中間體在日本等國家商業(yè)出售^[28]。利用SPase生產(chǎn)這些高價值的產(chǎn)品更經(jīng)濟(jì)快速，因此該酶具有重要作用及很高的經(jīng)濟(jì)價值^[1]。

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產(chǎn)品名稱	規(guī)格
蔗糖磷酸化酶（SPL-E）	1ku

產(chǎn)品名稱	規(guī)格	純度	2-α-GG content含量
甘油葡萄糖苷（a-GG）	1kg	＞90%	40-55%

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